三大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化課件

大腸桿菌感受態(tài)細胞

制備及轉化

大腸桿菌感受態(tài)細胞

制備及轉化1實驗目的掌握制備和保存大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法掌握轉化的方法技術了解轉化過程中各因素對轉化率的影響實驗目的掌握制備和保存大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法2感受態(tài)及轉化實驗原理定義感受態(tài)（Competence)：細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)轉化（transformation)：異源DNA分子導入受體細胞的過程致敏過程:用理化方法誘導細胞進入感受態(tài)的操作感受態(tài)及轉化實驗原理3在生長周期的任何時刻自動產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g.枯草桿菌）在生長周期的特定時刻產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g.大腸桿菌）細菌產(chǎn)生感受態(tài)的類型在生長周期的任何時刻自動產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g.枯草桿菌）細4受體菌與質粒的選擇

受體菌：

E.ColiDH5α：無Ap抗性外源質粒

Ampr抗性基因編碼一種周質酶（β-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割Amp的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力

選擇:

如進行藍白斑篩選時可選用DH5α、JM109、TG1；用T7啟動子進行原核表達時可選用BL21(DE3)；受體菌與質粒的選擇

受體菌：5制備感受態(tài)細胞方法

原生質體法電擊法特殊試劑誘導法：CaCl2誘導法制備感受態(tài)細胞方法6

+質粒DNA420C熱擊復蘇Amp+細菌處于00C,CaCl2低滲溶液中,菌細胞膨脹成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細胞表面,經(jīng)短時間420C熱擊處理,促進細胞吸收DNA復合物。將細菌放在非選擇性培養(yǎng)基上保溫一段時間，使抗氨芐青霉素的表型表達后再轉到含氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上，長出來的菌即為轉入了外源基因的菌株。+質粒DNA420C熱擊復蘇Amp+細菌處于00C,CaC7轉化率定義及計算公式：轉化子數(shù)/ugDNA=單菌落數(shù)質粒濃度(ng/ul)X

1uL2.5ng/uLX10x1000轉化率定義及計算X10x10008影響轉化效率的因素細菌的生長狀態(tài)：大腸桿菌在對數(shù)中期易產(chǎn)生感受態(tài)OD值：0.3－0.5(5X107個/ml)試劑的質量：化合物及無機離子：Rb+、Mn+、二甲亞砜等質粒：大小、構型外源DNA（質粒）與細胞的比例：器皿的潔凈度污染—盡量所有打開器皿蓋的操作都在超凈臺中進行影響轉化效率的因素細菌的生長狀態(tài)：大腸桿菌在對數(shù)中期易產(chǎn)生感9感受態(tài)細胞的保存

制備好的感受態(tài)細胞每100uL分裝一支EP管輕輕混勻----可以用tip頭輕輕攪勻.

4℃保存（不加甘油），可保存一周；加30%甘油，-20℃保存，可保存一月；加30%甘油，80℃保存，可保存六月；感受態(tài)細胞的保存制備好的感受態(tài)細胞每100uL分裝一支E10實驗器材搖床分光光度計冷凍離心機超凈工作臺恒溫水浴涂布棒恒溫培養(yǎng)箱實驗器材搖床11實驗試劑LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基氨芐青霉素0.1MCaCl230%甘油實驗試劑LB液體培養(yǎng)基12實驗流程1、接單菌落到5mlLB液體培養(yǎng)基中，370C、190rpm振蕩培養(yǎng)過夜2、5%（250ul)菌液接種到含5mlLB的試管中，370C振蕩培養(yǎng)1-2小時，至OD6000.4-0.5（已完成）3、將1.5mL菌液轉移到離心管中4、離心5000rpm，40C，5min5、倒出培養(yǎng)液實驗流程1、接單菌落到5mlLB液體培養(yǎng)基中，370C、1136.用冰預冷的1mL0.1M的CaCl2處理、懸浮細胞，7.冰上20min8.(取1.5mL)5000rpm離心5min，傾去上清9.100uLCaCl2輕輕懸浮，冰浴大腸桿菌DH5α感受態(tài)的制備6.用冰預冷的1mL0.1M的CaCl2處理、懸浮細14實驗流程大腸桿菌DH5α受態(tài)的制備--------1ml-----------20min實驗流程大腸桿菌DH5α受態(tài)的制備--------1ml-15實驗流程質粒的轉化1.實驗樣品:吸取50uL感受態(tài)細胞到另一個1.5mlEP管中，加入1uL質粒（槍頭輕輕混勻，勿吹打）

2.陰性對照：

DH5α感受態(tài)細胞50uL冰浴20mins42℃90秒（靜置，勿搖動）迅速放到冰上,冰浴2mins加入950uLLB培養(yǎng)基，標明組號，37℃200rpm搖床培養(yǎng)45mins實驗流程質粒的轉化1.實驗樣品:吸取50uL感受態(tài)細胞到16

制備LB瓊脂平板(已完成)

含Ap的LB固體培養(yǎng)基倒平板,每組5個.（編號1,2,3,4,5）不含Ap的LB固體培養(yǎng)基平板。（編號6）涂布

樣品(轉化培養(yǎng)后的菌液),涂布于1,2,3,4,5號平板，各100uL。

陰性對照(轉化培養(yǎng)后的菌液)100uL：涂布于6號平板。

靜置15mins,倒置平板37℃培養(yǎng)過夜

制備LB瓊脂平板(已完成)17涂布棒的使用

酒精燈的使用使用前，浸入75%酒精中；在酒精燈上引燃涂布棒上的酒精（不要燒到手）；等酒精燒完后，讓涂布棒在空氣中冷卻；涂布均勻；將涂布棒重新除菌以備下一次使用。涂布棒的使用18觀察結果（明天上午）預期實驗結果：1-4號平板上出若干單菌落，說明？

5號平板上沒有可見菌落，說明？

6號平板上出現(xiàn)大量菌落，說