細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定及其它試驗操作規(guī)程

細(xì)菌生化反響鑒定及其它試驗操作規(guī)程細(xì)菌生化反響鑒定及其它試驗操作規(guī)程1、氧化-發(fā)酵試驗(O-F原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中，必需有分子氧參與的，稱為氧化型?？梢赃M(jìn)展無氧降解的，稱為發(fā)酵型(發(fā)酵型細(xì)菌在有氧無氧的條件下均能分解葡萄糖)。不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。方法：將待檢細(xì)菌同時穿刺接種兩支Hugh-Leifson培育基，其中一支培育基滴加無菌石蠟(或其它礦物油)，高度不少于lcm。35℃，24結(jié)果：培育基變黃表示細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，兩支培育基均無變化為產(chǎn)堿型或不分解糖型；兩支培育基均均產(chǎn)酸為發(fā)酵型。假設(shè)僅不加石蠟的培育基產(chǎn)酸為氧化型。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵細(xì)菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者均為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌問的鑒別。2、β-半乳糖苷酶(ONPG)試驗原理：細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶，分解鄰-硝基酚β-D-半乳糖苷(無色)生成鄰-硝基酚(黃色)。結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽性反響，一般在20-30分鐘內(nèi)顯色。應(yīng)用：主要用于緩慢發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。3、七葉苷水解試驗原理：有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，七葉素與培育基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反響，生成黑色的化合物。結(jié)果：培育基變黑為陽性，不變色為陰性。應(yīng)用：主要用于D群鏈球菌與其它鏈球菌的鑒別。前者為陽性，后者為陰性。也可用于革蘭陰性菌與厭氧菌的鑒別。4．甲基紅試驗原理：某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培育基pH值降至4.5以下，參加甲基紅呈現(xiàn)紅色為陽性。假設(shè)細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生的酸少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物，則培育基pH值仍在6.2以上，參加甲基紅呈現(xiàn)黃色為陰性。結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽性，橘紅色為弱陽性。黃色為陰性。應(yīng)用：主要用于鑒別大腸桿菌與產(chǎn)氣桿菌，前者陽性，后者陰性。此外腸桿菌科中變形桿菌屬、沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬和志賀菌屬等陽性，而腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬則為陰性。5、VP原理：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中，氧化為二乙酰，與精氨酸中的胍基作用生成紅色化合物。結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)消滅紅色為陽性，如無紅色消滅且于35℃4h后仍如故者即為陰性。應(yīng)用：本試驗與甲基紅試驗一起使用，由于前者陽性的細(xì)菌，后者通常為陰性。6、吲哚(靛基質(zhì))試驗原理：細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚(靛基質(zhì))，參加對位二甲基苯甲醛生成紅色玫瑰吲哚。結(jié)果：于兩者液面接觸處消滅紅色為陽性，無色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科的鑒定。6、尿素分解試驗原理：具有尿素酶(尿酶)的細(xì)菌，分解尿素產(chǎn)生大量的氨，培育基變堿。結(jié)果：培育基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定，奇異變形桿菌、一般變形桿菌為陽性，克雷伯菌屬、枸椽酸菌屬、雷氏普羅威登菌和摩根摩根菌為陽性。7、苯丙氨酸脫氨酶試驗原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨生成苯丙FeCl3結(jié)果：消滅綠色為陽性，應(yīng)馬上觀看結(jié)果，延長會引起退色。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科的鑒定，變形桿菌屬、普羅威登斯菌和摩根摩根菌均為陽性。腸桿菌科其它菌均為陰性。8、氨基酸脫羧酶試驗原理：具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，分解氨基酸脫羧生成胺和CO2使培育基變堿，指示劑轉(zhuǎn)變顏色。結(jié)果：比照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色(指示劑為溴甲酚紫)為陽性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。9、氧化酶試驗原理：氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對苯二氨氧化。生成有色醌類化合物。結(jié)果：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈紫色為陽性。為保證結(jié)果準(zhǔn)確性，應(yīng)作陰、陽性比照。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與假單胞菌的鑒別，前者為陰性。后者為陽性。10、過氧化氫酶試驗(觸酶試驗)原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和生態(tài)氧，繼而形成分子氧消滅氣泡。試劑：3％過氧化氫溶液方法：取菌置于干凈的試管或玻片上，然后滴加3％過氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3％過氧化氫于不含血液的細(xì)菌培育基中，馬上觀看結(jié)果。結(jié)果：有大量氣泡產(chǎn)生為陽性。不產(chǎn)生氣泡為陰性。應(yīng)用：革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均陽性。而鏈球菌均陰性。1l、硝酸鹽復(fù)原試驗原理：包括兩個過程：一是在合成過程中，硝酸鹽復(fù)原為亞哨酸鹽和氨。再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)菌內(nèi)其它含氮化合物。二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的受氫體，能使硝酸鹽復(fù)原的細(xì)菌從哨酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其它復(fù)原性產(chǎn)物。結(jié)果：消滅紅色為陽性。假設(shè)參加試劑后無顏色變化反響，可能是①硝酸鹽沒有被復(fù)原，試驗陰性。②硝酸鹽被復(fù)原為氨和氮等其它產(chǎn)物而導(dǎo)致假陰性，這時應(yīng)參加少許鋅粉，如消滅紅色則說明試驗確實(shí)為陰性。假設(shè)仍不產(chǎn)生紅色，說明為試驗為假陰性。應(yīng)用：本試驗在細(xì)菌鑒定中應(yīng)用廣泛。12、氧化酶(改進(jìn)法)試驗試劑：四甲基對苯二胺(TMPD)6.0g二甲基亞砜(DMSO)100.oml溶解TMPD于DMSO中，置于避光玻塞瓶中，可在室溫中保存幾個星期。方法：被檢菌株移種于 7％羊血瓊脂上，30℃需氧條件下孵育15～18h，刮取菌落涂布于無色濾紙片上，加l滴上述試劑，陽性者在2min內(nèi)呈深藍(lán)色。假設(shè)被測菌株移種在蛋白胨酵母浸出液瓊脂上，至少孵育3天以上，5～10min13、CAMP原理：B群鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，可促進(jìn)葡萄球菌的β-溶血素溶解紅細(xì)胞活性，因此在兩菌的交界處溶血力增加。消滅矢形(半月形)的溶血區(qū)。結(jié)果：在兩劃線交界處消滅箭頭樣的溶血區(qū)為陽性應(yīng)用：在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗陽性。14、O/129原理：O/129(二氨基喋啶)對弧菌屬、鄰單胞菌屬細(xì)菌有抑制作用，而對氣單胞菌無抑制作用。方法：將待檢菌均勻涂布于堿性瓊脂平板上，鑷取O/129紙片(含藥40ug)貼于平板上，35℃，18~24h，觀看結(jié)果。結(jié)果：消滅抑菌環(huán)為敏感，無抑菌環(huán)為耐藥應(yīng)用：弧菌屬、鄰單胞菌屬對O／129敏感，而氣單胞菌屬耐藥15、桿菌肽試驗原理：A群鏈球菌對桿菌肽幾乎全部敏感，而其它鏈球菌絕大多數(shù)對其耐藥。16、奧普托欣試驗原理：幾乎全部的肺炎鏈球菌對Optochin敏感，而Optochin對其它鏈球菌則無抑制作用17、．H2S原理：有些細(xì)菌能分解培育基中的含硫氨基酸(如胱胺酸、半胱胺酸)產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇到鉛或亞鐵離子，則生成黑色的硫化鉛或硫化鐵。結(jié)果：培育基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?yīng)用：主要用于腸桿菌科屬或種的鑒定。18、觸酶試驗(過氧化氫酶試驗)試劑：3%H202溶液，置棕色瓶內(nèi)于4℃陰暗處保存。方法：先挑取固體培育基上的菌落，置于干凈的玻片上，然后滴加3％過氧化氫溶液1～2滴。靜置之，lmin內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡的為陽性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性。19、葡萄球菌凝固酶和分散因子試驗葡萄球菌凝固酶試驗被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。試管法凝固酶試驗稱為葡萄球菌凝固酶，玻片法為檢測分散因子。分散因子試驗：取1滴蒸餾水于干凈的玻片上，用接種環(huán)挑取待檢菌一環(huán)置于蒸餾水中，制成濃的菌懸液，無自凝現(xiàn)象。然后加一環(huán)家兔血漿混合，10s內(nèi)觀看結(jié)果，消滅明顯細(xì)菌凝塊為陽性，否則為陰性。如超過10s可消滅假陽性，有10％～15％金黃色葡萄球菌呈假陰性，因此必需用試管法驗證分散因子試驗。操作過程中的留意點(diǎn)：10s必需制備深厚的均勻菌懸液。(3)用EDTA(4)加血漿后不要再混攪，以免細(xì)菌凝塊分散變小。(5)生長在高鹽培育基上的菌落可消滅自凝或假陽性。葡萄球菌凝固酶試驗：用生理鹽水將血漿4倍稀釋，取0.5ml。然后挑取3～5個菌落于稀釋血漿中，成濃菌懸液。置37℃水浴，3～4h后讀取結(jié)果，凝固者為陽性。假設(shè)陰性，連續(xù)觀看到24h，不凝固者為陰性。試驗應(yīng)同時作陽性、陰性比照。試管法葡萄球菌凝固酶試驗陽性者，應(yīng)見到明顯的纖維蛋白凝膠塊，消滅羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固，應(yīng)判為陰性。中間型葡萄球菌、豬葡萄球菌需要較長時間孵育，才可消滅陽性。凝固酶試驗應(yīng)考慮下述狀況：①某些金黃色葡萄球菌產(chǎn)生溶纖維蛋白酶，溶解纖維蛋白凝塊。②所用血漿缺乏纖維蛋白原。③試驗菌株不純。結(jié)果：玻片法以血漿中有明顯的顆粒消滅而鹽水中無自凝現(xiàn)象判為陽性；試管法以血漿凝固為陽