露點(diǎn)水勢儀用于植物活體原位水勢測定技術(shù)的優(yōu)化方案

露點(diǎn)水勢儀用于植物活體原位水勢測定技術(shù)的優(yōu)化方案

自20世紀(jì)80年代以來，利用熱能計算機(jī)化勢法在中國植物和土壤中的水勢應(yīng)用已被廣泛使用（janghaiandshejungo，1986）。同其它技術(shù)相比,熱電偶型水勢測定技術(shù)應(yīng)用范圍廣,反應(yīng)快速可靠,使用樣品量小,且具有能夠連續(xù)原位測定活體植物這一特有的優(yōu)點(diǎn),在國內(nèi)外已經(jīng)有了廣泛應(yīng)用(付愛紅等,2010,2012;Martinezetal.,2011;楊培林等,2012)。然而,該技術(shù)在用于活體植物水勢的原位測定時仍然有很大的困難。主要原因是由于葉片角質(zhì)層的存在,大多數(shù)植物的葉片被密封在測量探頭內(nèi)后,由于氣孔關(guān)閉,葉片水分向外擴(kuò)散困難,測定時往往需要數(shù)小時的水分交換平衡時間,甚至完全不能測定。為了解決這一問題,在大多數(shù)情況下都是采用測定離體葉圓片來代替活體測定(莊麗等,2006;Millsetal.,2009;付愛紅等,2010,2012;楊培林等,2012)。但是用離體葉圓片代替活體葉片測定存在較多的問題。首先,葉圓片在打孔取樣時會造成其四周有大量的細(xì)胞破損,致使細(xì)胞漿污染圓片四周的傷口,改變細(xì)胞間隙質(zhì)外體溶液原來的水勢;其次,由于測定時葉片角質(zhì)層的存在和氣孔的關(guān)閉,這時熱電偶接點(diǎn)和葉圓片的水分交換主要發(fā)生在葉圓片四周的傷口部位,特別是在操作過程中由于傷口水分蒸發(fā)造成傷口表面的破損細(xì)胞溶液濃縮,更會大大加重傷口破損細(xì)胞溶液對水勢測定的干擾。雖然市場上較早就有了技術(shù)成熟的商品化儀器并帶有較為詳細(xì)的說明書和操作規(guī)程(如Wescor公司的HR-33T,Decagon公司的WP4-T露點(diǎn)水勢儀),但由于這一技術(shù)的復(fù)雜性,在很多情況下即使完全按照廠商的操作說明仍然有可能無法得到可靠的結(jié)果。據(jù)報道,在有灌溉條件下的傍晚(20:00)用該技術(shù)在沙棗(Elaeagnusangustifolia)葉片中測到-11.65MPa(-116.5bar)以及在白榆(Ulmuspumila)葉片中測到-11.30MPa(-113bar)的超常低水勢(楊培林等,2012),甚至在受到滲透脅迫的胡楊(Populuseuphratica)中測到-59MPa(-590bar)的驚人的水勢值(莊麗等,2006)。相比之下,以色列Negev沙漠中的極端耐旱植物Artemisiaherba-albaAsso在旱季末當(dāng)植物體的含水量降低到僅有14%時的極端條件下(接近干燥種子的含水量)的葉片在午后也僅有-9.2MPa(-92bar)的最低水勢值(Kappenetal.,1972)。這表明用葉圓片代替活體原位測定植物的水勢有可能產(chǎn)生嚴(yán)重的誤差。如果水分平衡需要數(shù)小時(Millsetal.,2009;付愛紅等,2010,2012),那么葉圓片被長時間密封在葉室內(nèi)有可能發(fā)生代謝變化和缺氧等其它問題(Martinezetal.,2011)。為了解決這一問題,國外有報道用不同的方法去除或部分去除被測葉片的角質(zhì)層。例如,用金剛砂紙打磨葉片表面(Savageetal.,1984;Nardinietal.,2008);用有機(jī)溶劑,如二甲苯、氯仿、二氯甲烷(Schaeferetal.,1986;CompbellandMcInnes,1999)處理葉片待測部位;甚至可用在葉片待測部位扎出大量針眼來破壞角質(zhì)層的極端方法(KikutaandRichter,1992)等。但這些方法均過于激烈,或由于有機(jī)溶劑的毒害作用而導(dǎo)致的問題,因而都沒有能夠成為廣泛接受的測定規(guī)程。為了解決活體植物原位水勢測定的困難,減少或避免露點(diǎn)水勢儀使用不當(dāng)造成錯誤的結(jié)果,我們在上述已有的探索基礎(chǔ)上(HansenandBeck,1988;ZhuandBeck,1991),結(jié)合本實驗室近些年與國外同行的互相交流和野外實地測定中積累的一些經(jīng)驗,以Wescor公司的露點(diǎn)水勢儀結(jié)合L-51探頭為例,對原位水勢測定樣品的處理和測定、熱電偶接點(diǎn)的清潔度檢測和清洗方法、主要誤差來源及其處理對策等進(jìn)行了進(jìn)一步的探索,進(jìn)而在活體植物的實測中進(jìn)行了驗證,并形成了改進(jìn)后的原位活體測定規(guī)程。本文將詳細(xì)介紹改進(jìn)后的原位水勢測定技術(shù),希望能為廣大科研工作者提供一種快速且便捷的水勢測定方法。1葉片待測部位的測量植物材料為中國科學(xué)院甘肅省臨澤內(nèi)陸河流域綜合研究站附近沙漠中生長的沙棗(ElaeagnusangustifoliaL.)和胡楊(PopuluseuphraticaOliv.)以及魯東大學(xué)校園內(nèi)生長的木犀科丁香(SyringaoblataL.)?；铙w測定采用美國Wescor公司的L-51探頭連接同一公司的HR-33T微伏計。數(shù)據(jù)采集記錄使用NI-6009數(shù)據(jù)采集卡(美國NationalInstruments)和EasyDaq2.1版(泛華測控)記錄軟件連接計算機(jī)進(jìn)行。其中HR-33T微伏計表盤上的模擬信號輸出(滿量程輸出為10V)連接到NI-6009數(shù)據(jù)采集卡的模擬信號輸入端。數(shù)據(jù)采集頻率為10次/秒。為了保證整個水勢測定過程可控,包括針對水勢高低不同的樣品最佳冷卻時間的控制、即時監(jiān)測測量端是否受污染以及保證測定過程曲線的完全記錄,所有植物原位水勢測定均采用濕度測定模式(psychrometer模式)。葉片的待測部位用直徑大約為10–15μm的精制氧化鋁粉末(山東晶鑫晶體科技有限公司)部分磨除待測葉片的角質(zhì)層,加快熱電偶測量端與組織細(xì)胞之間的水分?jǐn)U散交換速度。具體的操作過程為:首先選取葉片的待測面(一般為葉片背面),在離葉片邊緣約3mm處用無毒記號筆輕輕畫一個內(nèi)徑約為5mm的圓;然后用醫(yī)用棉簽蘸取少量氧化鋁粉末并加1滴蒸餾水,在所畫的圓內(nèi)小心輕柔地旋轉(zhuǎn)研磨到被研磨葉片的憎水表面能夠被水分完全潤濕(即研磨部位剛出現(xiàn)顏色變深)為止。在每株待測植物上都連接4個水勢探頭,保證每次測定至少有3個可重復(fù)的數(shù)據(jù)。葉片水勢探頭與葉片間的密封材料用凡士林或軟橡膠環(huán)。葉片待測部位研磨結(jié)束時,用高純水清洗研磨部位并用濾紙吸干水分,然后將葉片的被研磨處朝上,葉片下面墊上2–3mm厚的海綿或軟泡沫塑料片。將待測葉片連同海綿或軟泡沫塑料片一起插入L-51探頭的鋁合金底座,并將葉片的被研磨部位對準(zhǔn)L-51探頭的鋁合金底座上方圓孔的正中,最后將L-51探頭插入鋁合金底座上方的圓孔并擰緊側(cè)面的塑料螺絲固定。如果用軟橡膠環(huán)密封,可以將軟橡膠環(huán)平放入L-51探頭的鋁合金底座上方圓孔中,用L-51探頭將橡膠環(huán)推下壓到待測葉片上形成密封。如果用凡士林密封,需要事先在L-51探頭外圍涂上一圈凡士林,形成一圈高約1mm的“凡士林圍墻”(一般可用1個5mL或10mL的醫(yī)用注射器裝進(jìn)凡士林來涂布)。安裝時將涂好凡士林的L-51探頭緩緩?fù)葡螺p壓到待測葉片上形成密封。為避免研磨過度損傷細(xì)胞造成的測定誤差,在葉片上安裝探頭最好選在早晨或晚上植物水勢較高時進(jìn)行。由于這時植物的水勢較高,如果出現(xiàn)過度研磨造成細(xì)胞漿滲漏,將會測到比水勢值明顯低很多的滲透勢值,這樣容易判斷是否研磨過度。探頭安裝好15分鐘以后,如果4個探頭中有2個或2個以上的探頭給出測量值相互接近,并且明顯高于細(xì)胞漿滲透勢的水勢讀數(shù)值時可以認(rèn)為這幾個探頭安裝成功。為了確認(rèn)這一點(diǎn),可以在實驗開始時有意過度研磨1個葉片并測定出胞漿的滲透勢值作為探頭安裝是否成功的參考。安裝不成功的探頭需要將其打開,另找新的葉片重新研磨安裝,直到與其它的探頭讀數(shù)接近為止。探頭安裝成功后,研磨部位由于角質(zhì)層被破壞使局部蒸騰加快,在探頭安裝過程剛完成后,水勢一般比待測植物其它部位要低,需要等待15分鐘使之與整株植物達(dá)到水勢平衡。這需要在探頭安裝完成后不斷地測定水勢,等測到的水勢值穩(wěn)定不再上升時就可以認(rèn)為已經(jīng)達(dá)到平衡。為了緩沖溫度劇烈變化造成的測定誤差,安裝好葉片的探頭外面需要用鋁箔環(huán)繞以遮擋陽光直射和風(fēng)引起的探頭溫度快速變化。研磨后的葉片在測定時,如果熱電偶通電冷卻后輸出的信號沒有出現(xiàn)溫度下降平臺,說明研磨程度過低,角質(zhì)層沒有明顯磨穿,熱電偶上無水汽凝結(jié),這時也需要研磨新的葉片并重新安裝探頭。所有探頭都在使用前進(jìn)行標(biāo)定。標(biāo)定分別用300和800Osm·kg用于比較的植物水勢平行測定用ZLZ-5型壓力室水勢測定儀(蘭州大學(xué)制造)與露點(diǎn)水勢儀的測定同時進(jìn)行。2結(jié)果與討論2.1實測曲線參數(shù)圖1為陰天上午9:00對魯東大學(xué)校園內(nèi)木犀科丁香葉片進(jìn)行活體原位測定得到的一個實測曲線。具體參數(shù)為:微伏計設(shè)置在滿量程為30μV,對應(yīng)10V滿量程信號輸出,輸出信號每伏特代表3μV;熱電偶通電冷卻時間為2.1秒;數(shù)據(jù)采集頻率為10次/秒;切點(diǎn)坐標(biāo)是0.698V;熱電偶探頭標(biāo)定參數(shù)為0.531μV·0.1MPa2.2微伏特溫度設(shè)定及測試曲線圖2顯示在中國科學(xué)院甘肅臨澤內(nèi)陸河流域綜合研究站附近對沙漠中的沙棗樹的1個葉片進(jìn)行活體原位測定得到的一組實測曲線。具體參數(shù)為:微伏計設(shè)置在滿量程為30μV,對應(yīng)10V滿量程信號輸出,輸出信號每伏特代表3μV;熱電偶通電冷卻時間分別為3.5、8、12和18秒;數(shù)據(jù)采集頻率為10次/秒;切點(diǎn)坐標(biāo)是2.56V;熱電偶探頭標(biāo)定參數(shù)為0.516μV·0.1MPa2.3葉片原位測定圖3A為以采自魯東大學(xué)校園內(nèi)木犀科丁香的離體枝條在實驗室條件下(19–26°C,相對濕度45%–72%)的空氣中自然蒸發(fā)脫水24小時后,枝條上的一個葉片經(jīng)3次原位測定得到的一個實測曲線。圖3B為圖3A的中間部分(虛線方框中的部分)局部放大,而圖3B中的插圖為圖3B的右側(cè)虛線方框中的曲線局部放大。具體參數(shù)為:微伏計設(shè)置在滿量程為100μV,對應(yīng)10V滿量程信號輸出,輸出信號每伏特代表10μV;熱電偶通電冷卻時間為58–95秒;數(shù)據(jù)采集頻率為10次/秒;切點(diǎn)坐標(biāo)是3.56V(圖3B);熱電偶探頭標(biāo)定參數(shù)為0.467μV·0.1MPa2.4植物體水勢的日變化將L-51探頭在植物上原位固定好后,就能夠用露點(diǎn)水勢儀連續(xù)測定植物體水勢的日變化規(guī)律。圖4顯示中國科學(xué)院甘肅省臨澤內(nèi)陸河流域綜合研究站附近沙漠中生長的沙棗和胡楊葉片水勢變化的原位測定結(jié)果,從圖中可以清楚地看到兩種植物水勢的日變化特征和大小。2.5露點(diǎn)水勢儀的現(xiàn)場測量與壓力室內(nèi)水勢法的比較圖5為露點(diǎn)水勢儀原位測定木犀科丁香葉片與壓力室同一植株上其它枝條水勢測定法的3個時間點(diǎn)的比較,可以看出兩者測定值非常接近。2.6砂紙研磨葉片表面我們的實驗結(jié)果表明,用氧化鋁粉末研磨葉片并在濕度測量模式下,用露點(diǎn)水勢儀能夠較好地進(jìn)行活體植物水勢的原位測定,并可根據(jù)需要以最短間隔2分鐘1次的頻率連續(xù)測定。雖然近年仍有學(xué)者嘗試在不磨除角質(zhì)層,即完全不傷害植物的條件下進(jìn)行活體原位測定(Glennetal.,2010;PanteraandPapanastasis,2012),但由于角質(zhì)層對水分的擴(kuò)散阻力太大,這些測定結(jié)果均不理想。應(yīng)用葉圓片或者在待測葉片上扎上大量針眼的方法雖然解決了水分?jǐn)U散的問題,但由此也造成細(xì)胞漿在傷口處大量流出,并與細(xì)胞間隙的質(zhì)外體溶液混合,使測量結(jié)果的可靠性受到嚴(yán)重影響(KikutaandRichter,1992;Millsetal.,2009),因此出現(xiàn)一些超?；蛄钊苏痼@的結(jié)果(莊麗等,2006;楊培林等,2012)。用砂紙打磨葉片表面雖然能夠去除葉片角質(zhì)層(Savageetal.,1984;Schaeferetal.,1986;CampbellandMcInnes,1999;Nardinietal.,2008),但由于葉片表面在微觀狀態(tài)下并不是平面,結(jié)果可能會造成葉片表面的凸起部分過度磨損受傷,細(xì)胞漿流出干擾測定,而凹陷部分則完全得不到研磨。有機(jī)溶劑雖然能夠有效去除角質(zhì)層并避免機(jī)械傷害,但由于有機(jī)溶劑能夠破壞細(xì)胞的膜系統(tǒng),故不能夠得到廣泛的認(rèn)可。相比之下,應(yīng)用顆粒微小的氧化鋁粉末和棉簽研磨,一方面比較溫和,另一方面氧化鋁粉末也能與葉片表面的凹陷部位接觸摩擦而破壞該處的角質(zhì)層,因而能夠在葉片損傷較低的條件下較好地去除角質(zhì)層。由于氧化鋁微晶有僅次于金剛石的硬度,具有較好的研磨特性,同時氧化鋁微晶又不溶于水,不會導(dǎo)致葉片被研磨部位滲透勢的改變,因此我們認(rèn)為能較好地代替砂紙或有機(jī)溶劑。另外非常重要的一點(diǎn)是,在露點(diǎn)水勢儀的測定模式上,我們強(qiáng)烈建議使用濕度測定模式(psychrometricmode),不建議使用露點(diǎn)測定模式(hygrometricmode)。雖然濕度測定模式的靈敏度略低于露點(diǎn)測定模式,但應(yīng)用濕度測定模式能夠隨時監(jiān)測實驗是否出現(xiàn)假象,控制冷卻時間,監(jiān)測探頭是否受污染,可以隨時發(fā)現(xiàn)實驗中出現(xiàn)的問題并立即糾正;而應(yīng)用露點(diǎn)測定模式則像黑箱作業(yè),完全無法判斷實驗是否出現(xiàn)錯誤,也無法了解探頭是否被污染,甚至對樣品的冷卻時間都無法確定,因此很容易出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。從圖3的冷卻曲線可知,Wescor公司的露點(diǎn)水勢儀探頭的水汽凝結(jié)極限大約為–7.6MPa(從圖3的冷卻曲線上部已經(jīng)走平這一點(diǎn)可以看出,無論是用濕度還是露點(diǎn)測量模式),因此明顯超過這一數(shù)值的測定結(jié)果將是假象(探頭個體之間因為有小的個體差別,但應(yīng)該在-7.6MPa左右)。由于這個原因,我們也建議在使用美國Wescor公司的露點(diǎn)水勢儀時,最好使用帶有信號輸出的HR-33T型露點(diǎn)微伏計而不是使用同一公司較新型的PSYPRO型露點(diǎn)微伏計。另一方面基于熱電偶原理的露點(diǎn)水勢儀對測定過程中的冷卻和平衡這兩個過程中的溫度變化非常敏感,為了盡量減少測定誤差,還需要給安裝好葉片的探頭進(jìn)行一些隔熱緩沖措施。通過這些措施和處理,一般都能得到較為理想的結(jié)果。上述措施構(gòu)成了活體植物原位水勢測定的實用流程。隨著人們對于熱電偶型水勢測定技術(shù)的理解日趨深入及經(jīng)驗的不斷積累,這一技術(shù)必將能夠在植物生理生態(tài)學(xué)的研究中得到更廣泛的應(yīng)用。3其他描述3.1接頭的清洗方法圖6A和圖6B顯示露點(diǎn)水勢儀探頭不同的受污染程度和測定時沙棗的水勢測定曲線。判斷探頭是否被污染取決于熱電偶接點(diǎn)冷卻后的升溫曲線是否出現(xiàn)平臺(或肩狀),如圖6中的箭頭所示。圖6A為探頭輕度污染的曲線,但仍可以看到有肩狀;圖6B則為探頭污染較嚴(yán)重的曲線,已經(jīng)沒有明顯的肩狀。當(dāng)測定時出現(xiàn)圖6A所示的曲線時探頭仍可使用,但如果出現(xiàn)圖6B所示的曲線時探頭就需要清洗,否則會產(chǎn)生較大的測定誤差,使讀數(shù)絕對值變小。對于一般的污染,可以用高純水滴在探頭裝有熱電偶的凹陷中,浸泡熱電偶的測量端幾分鐘后用吹氣瓶吹去水滴,如此反復(fù)3–5次,多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。雖然在少數(shù)情況下不一定非常徹底,但探頭經(jīng)過這樣的清洗一般可以繼續(xù)使用一段時間,建議在野外時可以使用此方法。清洗過的探頭是否清潔可以用NaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液試測。如果測定曲線上有接近水平的平臺(肩)就是干凈的;反之,如果平臺傾斜嚴(yán)重說明仍然有污染,可以再次清洗。對于重度污染或凡士林進(jìn)入探頭凹陷的污染,需要加熱清洗。這時需要一個300–500J·s清洗時,先在錐形瓶內(nèi)加入約為瓶高1/4到1/3的高純水和少量事先用高純水浸泡沖洗3次的石英砂(注意清洗石英砂時不能煮沸),然后將錐形瓶放到電爐上,打開電爐電源,等瓶內(nèi)水沸騰時適當(dāng)減小火力(以保持玻璃滴管口有蒸氣流穩(wěn)定噴出為宜)。待玻璃滴管口蒸氣連續(xù)噴出約30秒后(蒸汽清洗玻璃管),就可以開始清洗探頭。操作時要注意安全,第1,橡皮塞要塞緊;第2,要調(diào)節(jié)電爐的功率,不使瓶內(nèi)壓力過大噴氣速度過高,以防止橡皮塞被壓力頂出。另外注意操作人員的頭部不要處在橡皮塞的正上方。清洗前應(yīng)事先用濾紙將探頭凹陷處外圍沾染的凡士林或其它污染物清理掉。這一步要特別小心操作,切忌濾紙碰到凹陷內(nèi)的范圍,由于探頭內(nèi)的熱電偶絲非常脆弱,即使是非常柔軟的小紙條,一旦碰到也會斷裂,探頭將完全報廢。清理完成后,將去除外圍污染物的探頭的凹陷朝下,呈約45度角對準(zhǔn)錐形瓶上玻璃滴管口正上方的蒸氣流(離噴氣管口上方約3cm的位置),緩緩旋轉(zhuǎn)探頭,當(dāng)探頭凹陷中有凝結(jié)的水滴并被蒸氣吹走3–4次后,將探頭從噴氣口移開,然后用移液槍吸入丙酮,用1mL丙酮重復(fù)2次沖洗探頭的凹陷處。丙酮沖洗后再將探頭移到錐形瓶的水蒸氣噴氣口上再次清洗1遍,最后再用丙酮沖洗2次以降低熱電偶接點(diǎn)表面的極性。經(jīng)過這樣2–3次反復(fù)清洗,探頭一般都會達(dá)到很高的清潔度。但是如果不是嚴(yán)重污染或凡士