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綠葉素含量是植物生理狀態(tài)的重要指標，與植物生長發(fā)育密切相關。目前,存在多種測定植物葉綠素含量的方法,主要包括傳統(tǒng)的Arnon法滸苔作為一種大型綠藻,藻體由一層細胞組成,管狀中空1材料和方法1.1酶解藻體(1)實驗材料:滸苔樣品于2014年6月28日取自青島近岸漂浮滸苔,先用滅菌海水清洗干凈,并在實驗室培養(yǎng)3d,實驗時挑選未釋放孢子、無白化、顏色均勻一致的滸苔藻體。(2)葉綠素提取劑:80%丙酮:用純丙酮和蒸餾水(8∶2)配成混合液備用。95%乙醇:分析純。丙酮-乙醇混合液:用純丙酮和無水乙醇(5∶5)配成混合液備用。丙酮-乙醇水混合液:用純丙酮、無水乙醇和蒸餾水(4.5∶4.5∶1)配成混合液備用。(3)主要儀器:UV-6100S型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);EppendorfCentrifuge5804R離心機。1.2實驗方法1.2.1相關吸收劑提取(1)研磨法將滸苔藻體清洗干凈去除污物,用濾紙吸干表面水分備用。用電子天平稱取滸苔樣品0.1g,共3份,分別放入研缽中,加入2~3mL提取劑,研成均漿,再加提取劑3mL,繼續(xù)研磨至組織變白,然后轉移至50mL具塞離心管中,用少量提取劑沖洗研缽、研棒及殘渣一起倒入離心管中,最后用提取劑定容至25mL,搖勻,靜止3~5min。在20℃條件下,以6000r/min的轉速離心10min,取3mL上清液置于光徑1cm的比色杯內。以對應的提取劑為空白對照,在波長663nm、645nm及652nm下測定吸光度,每個樣品重復3次(2)浸提法將清洗干凈的滸苔藻體用濾紙吸干表面水分,稱取0.1g藻體剪碎,長度約2mm左右。然后放入50mL具塞離心管中,加入25mL提取劑,20℃避光浸提,待測。提取液分別在663nm、645nm及652nm下測定吸光度,重復3次。1.2.2提取液用量的確定稱取0.1g滸苔藻體,分別用研磨法和浸提法提取葉綠素,分別加入上述4種提取液定容至25mL,每個處理設3個重復。待完全提取后取上清液分別在600~800nm波長范圍內掃描吸收光譜,比較吸收光譜間的差異。1.2.3種提取劑和兩種提取方法對1.2葉綠素含量的影響采用研磨法和浸泡法提取滸苔葉綠素時,采用上述4種提取液提取葉綠素,分別測定0、0.5、1、2、4、8、16、24h的葉綠素含量變化,比較上述4種提取劑和兩種處理方法提取滸苔葉綠素的效果差異。1.2.4不同提取劑的穩(wěn)定性試驗用不同提取劑提取滸苔葉綠素,在20℃生化培養(yǎng)箱中避光放置0、1、2、3、6d后測定提取液中葉綠素含量,比較葉綠素在不同提取劑中的穩(wěn)定性。1.3測定總色素的含量取3mL葉綠素提取液盛入10mm比色皿中,用提取劑作空白對照,用UV-6100S型紫外可見分光光度計測定645、652、663nm處的光密度值,并根據Arnon公式求得色素的濃度后,再按下式計算組織中單位鮮重的各種色素的含量:2.1葉綠素提取劑為復合溶劑的吸收光譜4種葉綠素提取劑通過研磨法和浸提法提取的滸苔葉綠素在600~800nm范圍內的吸收光譜基本相似(圖1),說明4種不同葉綠素提取劑的光吸收性質基本相似,可以運用Arnon公式進行葉綠素含量的計算。2.2不同提取劑對胡薩維提取總量的影響雖然,陳福明等2.3乙醇水混合液對葉綠素提取效果的影響黃帆浸提法提取葉綠素速度最快的是95%乙醇,在第3d時葉綠素被完全提取,藻體碎片變白;其次是丙酮乙醇混合液,在第6d時葉綠素基本被完全提取;再次是80%丙酮和丙酮乙醇水混合液,在第9d時提取葉綠素含量才達到最大值。由表2可知,不同葉綠素提取液放置9d后,Chla下降了3.9%~10.9%,Chlb下降了7.5%~21.2%,葉綠素總量下降了5.3%~14.8%。在20℃的黑暗條件下,葉綠素在4種提取液的穩(wěn)定性均較好,穩(wěn)定性的大小依次為:80%丙酮>丙酮乙醇混合液>95%乙醇>丙酮乙醇水混合液。雖然,葉綠素的穩(wěn)定性較差在光照條件下降解較快,但我們的結果表明,在黑暗的條件下,葉綠素的穩(wěn)定性較好。因此,葉綠素的提取與存放應該注意避光。3酶提取方法(1)4種提取液提取滸苔葉綠素的吸收光譜在600~800nm范圍內基本相似,可以采用Arnon公式計算葉綠素含量。(2)通過研磨法和浸提法提取葉綠素比較,采用研磨法提取滸苔葉綠素的提取效率高,在第0h時就能提取95%以上,而采用浸提法提取葉綠素時提取不完全,浸提時間長。(3)4種提取液,其中95%乙醇提取總量少,提取速度較快,穩(wěn)定性稍差;80%丙酮提取總量多,提取速度稍慢,穩(wěn)定性好;丙酮乙醇混合液提取總量少,提取速度慢,穩(wěn)定性較好;丙酮乙醇水混合液提取總量多,提取速度較快,穩(wěn)定性差。Chla濃度(mg/L):Chla=12.72AChlb濃度(mg/L):Chlb=22.88A葉綠素總濃度(mg/L):Chl(a+b)=Chla+Chlb=20.29A2不同提取方法對于提取葉綠素的影響從葉綠素的提取速度上來看,研磨法要優(yōu)于浸提法。運用研磨法的4種提取劑在第0h提取滸苔葉綠素含量均能達到完全提取葉綠素含量的95%以上。而采用浸提法的4種提取劑中,提取最快的提取液-95%乙醇在24h后提取葉綠素含