葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)大鼠炎癥性腸病模型的建立及結(jié)腸上皮變化

葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)大鼠炎癥性腸病模型的建立及結(jié)腸上皮變化

選擇合適的動(dòng)物模型是研究炎癥性腸?。╥bd）的不可或缺的手段。雖然imd有很多動(dòng)物模型，但仍然不理想。我國(guó)廣泛使用的imd模型是葡萄糖硫酸鈉（sds）誘導(dǎo)結(jié)腸、胰腸，病變主要位于腸道，其病理表現(xiàn)符合人類接受的牙齒特征。腸上皮是腸道的重要防御屏障,阻止腸道病原菌、抗原、毒素等的自由通過,是維持腸組織免疫平衡的前提條件;腸黏膜屏障破壞,通透性增加,允許腸道抗原以及微生物跨過屏障進(jìn)入腸黏膜,活化固有層免疫細(xì)胞,觸發(fā)炎癥反應(yīng)。為進(jìn)一步了解腸黏膜損傷的可能機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)使用DSS誘導(dǎo)大鼠建立IBD動(dòng)物模型,研究慢性修復(fù)期IBD大鼠結(jié)腸黏膜通透性以及腸黏膜緊密連接蛋白的表達(dá)變化,為進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件54只健康、清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,使用許可證號(hào)SYXK(浙)2007-0098,體重130～150g。每3只飼養(yǎng)于室溫22±2℃、相對(duì)濕度55%～65%的籠中,12h晝夜交替。飲水經(jīng)高溫高壓滅菌處理,大鼠可自由飲食飲水。1.2逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量pcrDSS(MW:5000Da)購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司,髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;AxyPrep小量RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)AxygenBiosciences公司;逆轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR(real-timePCR)試劑盒購(gòu)自日本Takara公司;β-actin抗體購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所;兔抗occludin抗體(ab31721)、兔抗claudin3抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;兔抗ZO-1(Mid)、小鼠抗claudin2抗體購(gòu)自美國(guó)LifeTechnologies公司;HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所;FITC標(biāo)記二抗購(gòu)自日本DAKO公司;7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;Ussingchamber購(gòu)自美國(guó)WPI公司;SDS電泳儀、電泳槽以及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。1.3主要實(shí)驗(yàn)方法1.3.1u3000儲(chǔ)備ipd模型54只大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后,記為第0天,隨機(jī)分為對(duì)照組和IBD模型組,每組27只。按照Okayasu等的方法制備IBD模型:每日配置新鮮3%DSS(w/v)經(jīng)飲水途徑飼養(yǎng)6d,第7天以滅菌水替換DSS,自由飲水14d。對(duì)照組全程自由飲水。分別在DSS處理后第7天、14天和21天取材,留取抗凝血、血清及腸道標(biāo)本,其中血清標(biāo)本于-20℃保存,結(jié)腸標(biāo)本于-80℃低溫保存,用于Westernblot和real-timePCR檢測(cè)。1.3.2動(dòng)物模型一般生長(zhǎng)指標(biāo)評(píng)價(jià)(1)癥狀、體征:記錄每天動(dòng)物的一般狀況,包括毛發(fā)、飲食、飲水、體重。綜合評(píng)價(jià)動(dòng)物的生長(zhǎng)狀態(tài)。每隔2d收集糞便,采用糞便隱血試劑盒測(cè)定大便隱血分?jǐn)?shù),依照Cooper疾病活動(dòng)度指數(shù)(diseaseactivityindex,DAI)評(píng)分方法評(píng)價(jià)動(dòng)物模型一般生長(zhǎng)狀況。(2)腸道組織病理變化:分別在第7天(n=6)、第14天(n=6)、第21天(n=9)處死大鼠,10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉后,取距離肛門4cm處2cm結(jié)腸于12%中性甲醛固定,石蠟包埋,制作5μm厚連續(xù)切片,蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察。1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別測(cè)量第7天、第14天、第21天結(jié)腸組織MPO酶活性,各取100mg結(jié)腸組織,冰上勻漿,12000g,4℃離心15min取上清,按照MPO試劑盒說明書提供的步驟操作,最后37℃孵育30min顯色,于460nm波長(zhǎng)下測(cè)量其吸收峰,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算每個(gè)樣本酶活力。1.3.4小鼠結(jié)腸完善感染isc和電勢(shì)差part的滲透,pda和sd大鼠小鼠腸道造模改造第21天測(cè)試通過Ussingchamber方法檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸黏膜跨膜電阻抗(transepithelialelectricresistance,TEER)、短路電流(shortcircuitcurrent,Isc)和電勢(shì)差(potentialdifference,Pd)。SD大鼠麻醉后截取長(zhǎng)約1.5cm的結(jié)腸,剝除漿膜層和肌層。將分離好的結(jié)腸黏膜固定于Ussingchamber裝置中,即刻于裝置的黏膜側(cè)加入5mL生理鹽水,漿膜側(cè)加入5mLKreb液(2.25mmol/LKH2PO4,108mmol/LNaCl,3mmol/LKCl,2mmol/LCaCl2·2H2O,22mmol/LNaHCO3,8.9mmol/L葡萄糖,調(diào)整pH至7.4),有效滲透面積為0.504cm2。整個(gè)裝置置于37℃恒溫環(huán)境中,并不斷于兩側(cè)的介質(zhì)中通入95%O2、5%CO2的混合氣體至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。待系統(tǒng)穩(wěn)定后記錄TEER、Isc、Pd并進(jìn)行分析。1.3.5pcr和引物的制備總RNA的提取:選用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒,按照試劑盒的說明進(jìn)行RNA的提取,反轉(zhuǎn)錄合成DNA第一鏈。Real-timePCR用QuantiTectSYBRGreenPCR試劑盒,取1μLcDNA用于反應(yīng)。擴(kuò)增條件:95℃變性30s,65℃退火30s,35～40次循環(huán)。引物采用Primer5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1),由美國(guó)LifeTechnologies公司合成。每次每樣本重復(fù)3次,采用2-△dct方法進(jìn)行半定量分析。1.3.6小鼠ecl檢測(cè)取50μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS電泳,通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉、一抗(β-actin抗體1∶4000;兔抗occludin抗體1∶400;小鼠抗claudin2抗體1∶700;兔抗claudin3抗體1∶1500;兔抗ZO-1抗體1∶600)4℃孵育過夜,TBST洗滌,二抗(山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG)孵育1h,TBST洗滌,增強(qiáng)ECL放射自顯影。用ImageProPlus軟件半定量分析。1.4資料均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較采用方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1大鼠的一般情況IBD模型組在第2天開始出現(xiàn)水樣腹瀉,相繼出現(xiàn)隱血陽(yáng)性、黏液血便、膿血。第5天和第6天IBD模型組大鼠均出現(xiàn)直腸便血;大鼠倦怠懶動(dòng)、消瘦、拱背、皮毛皺亂無光澤,伴有飲食、飲水明顯減少;在第12～13天左右,體重下降達(dá)到頂點(diǎn),隨后體重緩慢上升,伴便血、腹瀉癥狀逐漸緩解,大鼠飲水、飲食逐漸增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),IBD模型組大鼠體重(218±11g)顯著低于對(duì)照組(306±9g,t=-12.27,P<0.01)。2.2稀便或隱血評(píng)分檢測(cè)DSS處理后,IBD模型組大鼠DAI評(píng)分逐漸增加,在第11～12天左右達(dá)到最大值,后逐漸減小,2～3只大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),仍有稀便或隱血測(cè)試陽(yáng)性。2.3感染性炎性細(xì)胞不同顯微鏡觀察到對(duì)照組大鼠結(jié)腸上皮各層結(jié)構(gòu)清晰。IBD模型組大鼠腸道炎癥主要集中在遠(yuǎn)端結(jié)腸,第7天腸道炎癥表現(xiàn)為黏膜下層水腫,腸上皮糜爛、潰瘍,中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)達(dá)黏膜下層尚未及肌層,黏膜層多處出血灶;第14天炎癥加重、腸上皮嚴(yán)重壞死,杯狀細(xì)胞消失,隱窩紊亂、膿腫,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)范圍擴(kuò)大至肌層,黏膜層廣泛出血;第21天可見再生腸細(xì)胞以及少量異型增生,新生不規(guī)則隱窩,黏膜層漿細(xì)胞浸潤(rùn),腸上皮損傷周圍組織可見多個(gè)淋巴濾泡形成。見圖1。2.4外周血wbc計(jì)數(shù)第7天即觀察到IBD模型組大鼠結(jié)腸組織MPO酶活性和外周血WBC計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01),第14天達(dá)到高峰(P<0.01),第21天有明顯降低的趨勢(shì),但仍明顯高于對(duì)照組(P<0.01),見表2。2.5各組大鼠結(jié)腸黏膜ter和isc的比較第21天測(cè)試2組大鼠結(jié)腸黏膜Pd、TEER和Isc值,結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,IBD模型組大鼠結(jié)腸黏膜TEER值顯著減少(P<0.01),同時(shí)結(jié)腸黏膜Pd值也顯著下降(P<0.01),而IBD模型組大鼠結(jié)腸黏膜Isc值顯著高于對(duì)照組(P<0.01),見表3。2.6大鼠mrna的表達(dá)量第21天,對(duì)照組幾乎沒有檢測(cè)到claudin2mRNA的表達(dá),IBD模型組大鼠腸上皮表達(dá)claudin2mRNA。對(duì)照組大鼠結(jié)腸上皮claudin3mRNA的表達(dá)量是IBD模型組大鼠的5.1倍(t=9.26,P<0.01);occludinmRNA表達(dá)量是IBD模型組大鼠的13.06倍(t=9.18,P<0.01);ZO-1mRNA水平是IBD模型組的8.03倍(t=6.14,P<0.01)。IBD模型組大腸claudin5mRNA的表達(dá)量高于對(duì)照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.08,P=0.31)。兩組claudin1,claudin4,claudin7mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。2.7大鼠結(jié)腸黏膜所內(nèi)藥物成分的影響以β-actin為內(nèi)參,Westernblot檢測(cè)第21天大鼠腸黏膜上皮各蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果經(jīng)ImageProPlus軟件定量分析提示DSS顯著影響大鼠結(jié)腸黏膜上皮緊密連接蛋白的表達(dá)。同real-timePCR的結(jié)果相似,對(duì)照組沒有檢測(cè)到claudin2蛋白的條帶,IBD模型組claudin2蛋白表達(dá)陽(yáng)性,對(duì)照組大鼠ZO-1蛋白表達(dá)量是IBD模型組大鼠的2.2倍(t=38.15,P<0.01),occludin蛋白表達(dá)量是IBD模型組大鼠的2.3倍(t=11.54,P<0.01),claudin3蛋白表達(dá)量是IBD模型組大鼠的2.8倍(t=20.51,P<0.01)。見圖4。3小鼠腸道相關(guān)酶活性變化近年來,腸黏膜屏障功能在IBD的病理生理過程中的作用逐漸引起重視。機(jī)械屏障是腸黏膜屏障中重要的組成部分,由單層腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間的連接(包括緊密連接、黏附連接和縫隙連接)組成,緊密連接通透性具有大小和電荷選擇性,是決定腸道通透性的關(guān)鍵因素,維持完整的緊密連接形態(tài)和功能對(duì)保護(hù)腸黏膜屏障、防止細(xì)菌移位有著重大的意義;急性期IBD患者腸黏膜屏障受損,腸道通透性增加,腸上皮完整性受損,如潰瘍、糜爛等肉眼可見病變是引起屏障功能受損的主要原因,在上皮組織完整的腸黏膜區(qū)同樣檢測(cè)到緊密連接受損,通透性增加。Solomon等綜述了DSS誘導(dǎo)動(dòng)物制備IBD模型的特點(diǎn):短期(3～10d)DSS誘導(dǎo)動(dòng)物腸道出現(xiàn)急性損傷;正常飲水替換DSS后,大鼠腸黏膜經(jīng)歷14～21d的慢性修復(fù)期;DSS與飲水相互交替3～4個(gè)周期誘導(dǎo)動(dòng)物腸道持續(xù)性損傷,制備的動(dòng)物模型具有慢性腸道炎癥的特點(diǎn)。本研究中,IBD模型組大鼠出現(xiàn)體重下降、便血;腸上皮水腫、隱窩擴(kuò)張、膿腫,炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)等表現(xiàn),與Okayasu等和Cooper等一些實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果相同,同人類IBD相似。此外,本研究中病理結(jié)果提示6d持續(xù)3%DSS誘導(dǎo)腸道急性損傷,正常飲水替換DSS后,大鼠腸黏膜損傷逐漸修復(fù),大鼠DAI評(píng)分、MPO酶、WBC計(jì)數(shù)測(cè)試結(jié)果同樣提示制備的IBD大鼠經(jīng)歷急性炎癥和炎癥逐漸消退的過程,與Okayasu等和Whittem等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。由此可知給予SD大鼠短期3%DSS結(jié)合2周飲水誘導(dǎo)的IBD模型符合經(jīng)典的IBD模型,IBD大鼠經(jīng)歷急性腸黏膜損傷后進(jìn)入慢性修復(fù)期。TEER值是反映細(xì)胞質(zhì)經(jīng)胞旁途徑轉(zhuǎn)運(yùn)速率常用的生理指標(biāo),用于評(píng)估細(xì)胞旁路通透性的大小,反映緊密連接復(fù)合體通透性,具有很高的特異性;細(xì)胞旁路通透性的增加,表現(xiàn)為TEER的下降,反之,則TEER增加。Pd值是反映腸上皮完整性的指標(biāo),Isc是細(xì)胞Na、Cl、K、Ca、Mg離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的總和,反映腸上皮離子以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收狀況。本研究結(jié)果表明IBD大鼠結(jié)腸上皮TEER值降低提示IBD大鼠結(jié)腸緊密連接復(fù)合體通透性增加,腸黏膜屏障功能受損。臨床上,IBD患者黏膜上皮也存在電導(dǎo)增加,TEER值降低的現(xiàn)象。腸道電生理變化與腸道致炎癥物質(zhì)釋放密切相關(guān),Shimizu等的研究證實(shí)DSS誘導(dǎo)的IBD模型大鼠結(jié)腸緩激肽分泌增加,緩激肽可以誘導(dǎo)腸道Cl-的分泌,影響Na+和水的吸收,導(dǎo)致腸道TEER、Isc值變化,進(jìn)而腸通透性增加,進(jìn)而腹瀉發(fā)生?？傊?IBD大鼠腸道緊密連接復(fù)合體功能受損,腸黏膜屏障功能下降。緊密連接復(fù)合體由occludin、claudin及膜周蛋白JAM和ZO蛋白以及相關(guān)激酶組成。過表達(dá)occludin蛋白增加細(xì)胞TEER值;潰瘍性結(jié)腸炎患者腸上皮occludin熒光染色光密度值顯著下降;而occludin蛋白缺失的小鼠腸上皮結(jié)構(gòu)和細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)正常。claudin蛋白是組成緊密連接復(fù)合體的功能和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),claudin蛋白可直接影響上皮/內(nèi)皮組織TEER,決定緊密連接復(fù)合體的離子選擇性,并調(diào)節(jié)緊密連接復(fù)合體的通透性,一部分claudin加固細(xì)胞之間的連接,其表達(dá)上調(diào)可以降低緊密連接復(fù)合體的通透性,稱這一類為“封閉性”claudin蛋白,包括claudin1、claudin3、claudin4、claudin5和claudin8等。另一部分的claudin分子可以形成特異性離子通道而增加緊密連接復(fù)合體的通透性,可以稱這一類為“滲漏性”claudin,如claudin2增加緊密連接結(jié)構(gòu)孔的數(shù)量,增加經(jīng)細(xì)胞旁物質(zhì)運(yùn)輸,尤其是Na+離子的吸收。ZO-1蛋白將occludin、claudin蛋白與細(xì)胞骨架相連,在組裝成熟的緊密連接結(jié)構(gòu)和維持緊密連接復(fù)合體的完整性方面發(fā)揮重要的作用。本研究第21天real-tmePCR和Westernblot結(jié)果皆提示正常大鼠結(jié)腸上皮沒有claudin2蛋白的表達(dá),而IBD模型組大鼠結(jié)腸上皮claudin2蛋白表達(dá)陽(yáng)性,occludin、ZO-1、claudin3蛋白表達(dá)水平顯著降低。正常大鼠結(jié)腸組織不表達(dá)具有孔道特性的緊密連接蛋白claudin2,但在IBD大鼠可見claudin2在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá),“封閉性”緊密連接蛋白claudin3、組裝蛋白ZO-1的表達(dá)顯著下降,由此推測(cè)這些緊