雙向電泳技術(shù)的研究進(jìn)展

雙向電泳技術(shù)的研究進(jìn)展

2001年2月15日，全球人類(lèi)共同事件序列的完成意味著人類(lèi)將進(jìn)入后半部分的基本組時(shí)代。基因組時(shí)代的研究發(fā)現(xiàn),在揭示基因組精細(xì)結(jié)構(gòu)的同時(shí),也顯示出基因數(shù)量的有限性和基因結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性,這與生命現(xiàn)象的復(fù)雜性與多變性之間存在著巨大反差。這種反差的存在使人們認(rèn)識(shí)到,要研究生命現(xiàn)象,僅僅研究基因組的結(jié)構(gòu)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,必須對(duì)生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者-蛋白質(zhì)的重要性有更深刻的了解,因此,一個(gè)以“蛋白質(zhì)組”為研究重點(diǎn)的時(shí)代已悄然到來(lái)。“蛋白質(zhì)組”一詞的英文是PROTEOME,由PROTEins和genOME兩個(gè)詞組合而成,這一概念是由澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams在1994年提出的,是指基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì),廣義上講,蛋白質(zhì)組是指“一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”。作為研究蛋白質(zhì)組的三大核心技術(shù)之一,(另外兩種分別是計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù))。雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)是目前唯一可將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離的方法,雙向電泳技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)被公認(rèn)為是目前蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法本文擬就雙向電泳技術(shù)各個(gè)步驟的最新進(jìn)展做一綜述。1elp技術(shù)原理雙向電泳,又稱(chēng)作雙向凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis),由O′FarrelPH最早建立于20世紀(jì)70年代。該技術(shù)用于蛋白質(zhì)的分離,其操作步驟分為兩步,第一步稱(chēng)作等電聚焦(isoelectricfocusing,IEF),這一步的原理是將蛋白質(zhì)根據(jù)pH梯度分離至各自等電點(diǎn),通過(guò)電荷來(lái)分離蛋白質(zhì);第二步是十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)第二次分離是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小的不同將其在與第一向垂直或水平方向上分離。2蛋白質(zhì)抽提過(guò)種的制備方法如何從細(xì)胞組織中盡可能完整地,并且盡可能多的將蛋白質(zhì)以溶解狀態(tài)提取出來(lái),是蛋白質(zhì)組研究的首要步驟。樣品制備最基本的三個(gè)步驟是,組織或細(xì)胞的破碎,失活或者去除干擾物質(zhì),蛋白質(zhì)增溶溶解。由于蛋白質(zhì)不能溶化也不能蒸發(fā),其所能分配的物相僅限于固相和液相,并在這兩相間交替進(jìn)行分離純化。因此在制備樣品的過(guò)程中,就只能利用蛋白質(zhì)在此兩相中分配率的不同來(lái)提取。在蛋白質(zhì)抽提過(guò)種中,有幾條共同的原則需要遵循:一是盡可能多溶解全部蛋白質(zhì),打斷蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)鍵結(jié)合,使樣品中的蛋白質(zhì)以分離的多肽鏈形式存在;二是避免蛋白質(zhì)的修飾作用和蛋白質(zhì)的降解作用;三是避免脂類(lèi)、核酸、鹽等物質(zhì)的干擾作用;四是蛋白質(zhì)樣品與第一向電泳的相容性。2.1細(xì)胞或組織的破裂細(xì)胞破碎主要采用機(jī)械,物理和化學(xué)的方法進(jìn)行。由于細(xì)胞在破碎時(shí)會(huì)釋放出蛋白酶,因此加蛋白酶抑制劑。常用的細(xì)胞破碎方法有如下3種。2.1.1高速轉(zhuǎn)動(dòng)的嫌犯刀主要通過(guò)機(jī)械切力作用使組織細(xì)胞破壞。常用器械有:①高速組織搗碎機(jī)(轉(zhuǎn)速可達(dá)10000r/min,具有高速轉(zhuǎn)動(dòng)的鋒利的刀片),尤其適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織的破碎;②玻璃勻漿器,用兩個(gè)磨砂面相互磨擦,將細(xì)胞磨碎,適用于少量材料,也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等,兩面間隔只有十分之幾毫米,對(duì)細(xì)胞破碎程度較高速搗碎機(jī)高,機(jī)械切力對(duì)分子破壞較小。2.1.2樣品的預(yù)處理主要通過(guò)各種物理因素的作用,使組織細(xì)胞破碎。常用的方法有:①反復(fù)凍融法:現(xiàn)在使用的方法主要是將樣品在液氮中凍結(jié)后,迅速融解,再凍結(jié),再融解,如此循環(huán)多次,由于滲透壓的變化,使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性,冰片將細(xì)胞膜破碎,使蛋白質(zhì)可融化,成為粘稠的濃溶液。以前也有將樣品在冷藏庫(kù)或干冰中反復(fù)凍融的;②超聲波法:屬于較強(qiáng)烈的破碎方法,因?yàn)槌曔^(guò)程中會(huì)產(chǎn)熱,所以要求在冰浴上進(jìn)行,間歇處理,不同的樣品選擇不同的功率;③研磨法:將樣品加入瓷缽中,然后加液氮研磨成粉末。上述3種方法是物理方法中最基礎(chǔ)的,其余的方法均是在此3種方法上的衍變,其最基本的原理是一樣的。2.1.3液體輔助破碎細(xì)胞化學(xué)方法使用較少,主要是加入一些化學(xué)物質(zhì),利用化學(xué)反應(yīng)達(dá)到分離蛋白的作用。常用的方法包括:①有機(jī)溶媒法,多在0℃以下加入5~10倍量的丙酮,迅速攪拌均勻,可以破壞細(xì)胞膜,也可以破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合;②自融法,將待破碎的新鮮材料在一定的pH和溫度下,利用自身的蛋白酶將細(xì)胞破壞,使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái);③酶法,用一些蛋白酶除去變性的蛋白質(zhì)。與機(jī)械方法和物理方法相比,化學(xué)方法使用較少。2.1.4蛋白酶抑制劑①為避免因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性后在最后的圖像上引起偽點(diǎn)和大分子量蛋白的丟失,應(yīng)該使用蛋白酶抑制劑;②鹽離子會(huì)干擾電泳分離的過(guò)程,如果它們的濃度太高,大于100mmol/L就應(yīng)該去除;③多糖和核酸可以與載體兩性電解質(zhì)以及蛋白質(zhì)發(fā)生作用,并且會(huì)在2-D膠上引起條紋,所以要去除。2.2溶解過(guò)程控制經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎及干擾物質(zhì)的去除之后,個(gè)別的多肽要通過(guò)變性和還原來(lái)破壞分子內(nèi)或分子之間的相互作用,而且在溶解過(guò)程中還要保持內(nèi)在電荷的特性。樣品溶解經(jīng)常是在緩沖液(又稱(chēng)裂解液)中進(jìn)行,無(wú)論裂解液組成如何變化,其各個(gè)組份都應(yīng)該包含最基本的3種物質(zhì),分別是離液劑(又稱(chēng)促溶劑),去垢劑(又稱(chēng)表面活性劑)和還原劑。這3種物質(zhì)在樣品裂解液中的作用是無(wú)法使用其他物質(zhì)來(lái)替代的。2.2.1離液劑的種類(lèi)離液劑的作用是來(lái)破壞氫鍵等次級(jí)鍵的結(jié)構(gòu),使蛋白的肽鏈伸展開(kāi)來(lái),充分暴露疏水中心,降低接近疏水殘基的能量域。目前最常使用的離液劑是硫脲(thiourea),由Rabilloud首先介紹,硫脲非常適合用來(lái)打斷氫鍵之間的疏水作用,但是硫脲的不足之處在于其在水溶液中溶解性太差,因此限制了它的單獨(dú)使用。但是硫脲在一定濃度的脲溶液中溶解性增強(qiáng),目前,最好的解決方法就是將此二者聯(lián)用,5~7mol/L脲與2mol/L硫脲與合適的去垢劑聯(lián)用,可以增強(qiáng)蛋白溶解的效果。2.2.2非離子或兩性離子去垢劑去垢劑的作用在于破壞蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用。最常使用的去垢劑包括陰離子去垢劑SDS,非離子去垢劑TritonX-100和NP-40,兩性離子去垢劑CHAPS等。陰離子去垢劑SDS是最有效的表面活性劑之一,有人建議在沸騰的SDS溶液中進(jìn)行蛋白溶解。如果樣品在1%的SDS溶液中溶解而沒(méi)有在至少4倍的(脲或硫脲)裂解液中稀釋,使用非離子或兩性離子去垢劑來(lái)代替陰離子去垢劑SDS,使其的濃度降在0.2%以下,就會(huì)在2-D圖像中觀察到水平的條紋。因?yàn)?-DE上樣量的嚴(yán)格要求與為獲得SDS的足夠稀釋之間的矛盾,現(xiàn)在越來(lái)越多的使用非離子去垢劑和兩性離子去垢劑。最常使用的陰離子去垢劑是NP-40,TritonX-100和十二烷基麥芽苷。不足之外是TritonX-100和NP-40在溶解疏水性極強(qiáng)的膜蛋白不是十分有效。與之對(duì)比,兩性離子去垢劑如CHAPS,硫代甜菜堿在溶解膜蛋白方面作用更強(qiáng)。更精細(xì)的研究揭示,兩性離子去垢劑在溶解疏水性蛋白的有效性方面的原因,不僅是由于蛋白質(zhì)本身的特性,而且還在于一些其它物質(zhì)的特性,特別是樣品中的脂質(zhì)物。即便取得了很大的進(jìn)步,研究表明,不存在任何一種單一溶液能解決復(fù)雜的蛋白溶解問(wèn)題。多數(shù)膜蛋白不能在單一的非離子去垢劑或兩性離子去垢劑完全溶解,改善裂解液的配方,來(lái)提高膜蛋白的溶解度,仍然是非常重要的工作。2.2.3硫代赤蘚醇還原和防止二硫鍵的再次氧化也是樣品制備的一個(gè)關(guān)鍵步驟。還原劑在清除分子間或分子內(nèi)二硫鍵的相互作用,維持蛋白分子保持?jǐn)嗔逊矫嫫鹬匾饔?。最常使用的還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)或者二硫代赤蘚醇(DTE),這兩種還原劑的用量都較大,濃度要高于100mmol/L。DTT本身還帶有電荷,在等電聚焦時(shí),常常會(huì)遷移到pH范圍以外,從而使某些二硫鍵重新配對(duì),使溶解度降低而重新沉淀下來(lái)。Herbert等人最先建議使用非離子型還原劑三丁基磷(tributyl-phosphine,TBP)來(lái)替代DTT和DTE。因?yàn)門(mén)BP化學(xué)反應(yīng)的原因,其應(yīng)用濃度非常低,僅2mmol/L,而且可以大大增加蛋白質(zhì)的溶解性,并可幫助蛋白質(zhì)從第一向轉(zhuǎn)移到第二向。TBP的不足之處在于其在水溶液中的溶解度太差以及半衰期過(guò)短。2.2.4分步提取法:提取和細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞的表達(dá),是根據(jù)克對(duì)全細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)分離(pre-fractionation)是提高低豐度蛋白質(zhì)和膜蛋白檢出限的有效方法。一種是被稱(chēng)為分步提取法,其原理是基于蛋白質(zhì)的溶解度不同,采用3種不同的提取液對(duì)全細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行分步提取和分別電泳。還有一種預(yù)分離的方法稱(chēng)為多間隔電解法,此種方法實(shí)質(zhì)上是一種制備等電聚焦的方法。3固相ph梯度法分離金屬離子蛋白質(zhì)組研究的先決條件也是最大的挑戰(zhàn)就在于從復(fù)雜的生物樣品中將蛋白質(zhì)分離出來(lái),并且要求有很高的重復(fù)率和分辨率。O′Farrell′s最先發(fā)明的載體兩性電解質(zhì)(carrierampholyte,CA)雙向凝膠電泳技術(shù)成為了世界范圍分離復(fù)雜樣品蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法,但是,該方法即使在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室也很難獲得重復(fù)的結(jié)果,更不用說(shuō)不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果比較。重復(fù)性差的原因主要在于合成的CA,比如梯度不穩(wěn)定,聚焦時(shí)間過(guò)長(zhǎng),陰極漂流,不同時(shí)間制備的CA之間的變異等等。在實(shí)際應(yīng)用中,由CA產(chǎn)生的pH梯度很少能超過(guò)pH7.5,其結(jié)果將是堿性蛋白的丟失。真正的一向等電聚焦技術(shù)的突破是在Immobilines試劑的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)技術(shù)。IPG技術(shù)在很大程度上解決了重復(fù)性差的問(wèn)題。3.1解決酸性及堿性蛋白檢出率的問(wèn)題第一向等電聚焦是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同將其分離,為提高分辨率和蛋白質(zhì)的檢出率,必須不斷改進(jìn)膠條。一方面是膠條的pH范圍,在不斷變窄的同時(shí)也在不斷的擴(kuò)大。目前相差一個(gè)pH范圍的窄膠條及pH3~12的膠條均已有商品化,這些膠條的出現(xiàn),極大的改善了酸性及堿性蛋白的檢出率。另外一方面是膠條長(zhǎng)度的改變,目前有7cm,11cm,13cm,18cm及24cm,18cm有膠條是目前最常用的一向IEF膠條。有報(bào)道稱(chēng),使用更長(zhǎng)的膠條可以增加蛋白質(zhì)的分辨率和檢出率。上樣量根據(jù)考染或銀染及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌煌?一般來(lái)說(shuō)考染要求的上樣量較大。理論計(jì)算,2-D圖譜上將會(huì)有30%的堿性蛋白其等電點(diǎn)在pH12以上。對(duì)于極堿性蛋白的分離,寬pH范圍,如3~12或是4~12的IPG膠條更適合。在第二向分離之前需要進(jìn)行平衡,平衡的目的是通過(guò)平衡液中的DTT或β-巰基乙醇使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵保持還原狀態(tài),有利于SDS與蛋白質(zhì)的充分結(jié)合。3.2凝膠的分離和石鏡的制備SDS可以在水平或垂直兩個(gè)方向進(jìn)行。水平膠可利用預(yù)制膠在自制平板膠運(yùn)行,水平膠的優(yōu)點(diǎn)是凝膠附著在塑料支持膜上,在染色過(guò)程中可以防止凝膠大小發(fā)生變化,水平膠分離蛋白的邊緣要比垂直膠清晰,此外,蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布變形程度小。水平膠不能同時(shí)運(yùn)行兩塊膠,所以,為了同時(shí)運(yùn)行獲得圖譜的重復(fù)性,就要用垂直電泳。較之一向等電聚焦的變化來(lái)說(shuō),二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳自從問(wèn)世以來(lái),其變化不大。4蛋白質(zhì)鑒定法二維電泳后分離得的蛋白質(zhì)常規(guī)檢測(cè)和定量的普遍方法是考馬斯亮藍(lán)染色和銀染。這兩種染色方法相比,考染法具有染色過(guò)程簡(jiǎn)單,所需配制試劑少,操作簡(jiǎn)便,無(wú)毒性,染色后的背景及對(duì)比度良好,與下游的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)相容等優(yōu)點(diǎn),但是其不足之處在于靈敏度低,檢測(cè)蛋白的極限是8~10ng,對(duì)于低豐度蛋白難以顯色。銀染法的特點(diǎn)相對(duì)于考染法來(lái)說(shuō),優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,可達(dá)200pg,但其不足之處在于操作過(guò)程煩瑣,而且染色過(guò)程中醛類(lèi)的特異反應(yīng),使得對(duì)凝膠酶切肽譜提取存在困難,進(jìn)行質(zhì)譜鑒定之前增加了脫銀的步驟。隨著質(zhì)譜鑒定靈敏度的不斷提高,考染和銀染法用于蛋白質(zhì)組研究中的局限性逐漸暴露出來(lái),新的染色方法,如熒光染色,同位素標(biāo)記,負(fù)染法等等不斷出現(xiàn),新方法的出現(xiàn),都是從兩個(gè)方面在改進(jìn),第一,提高蛋白檢測(cè)的靈敏度,第二,增加與下游質(zhì)譜鑒定的兼容性。5蛋白分離和活性發(fā)展雙向凝膠電泳技術(shù)在目前仍然是蛋白質(zhì)組研究不可替代的分離方法,有很