第二章第一節(jié)基因操作的工具酶

第二章第一節(jié)基因操作的工具酶第1頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第二章基因操作原理第一節(jié)分子克隆的工具酶第二節(jié)載體第三節(jié)電泳技術與分子雜交技術第四節(jié)聚合酶鏈式反應第五節(jié)基因克隆的策略第六節(jié)生物芯片第七節(jié)基因文庫的構建第八節(jié)分子標記技術第2頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)基因操作的工具酶一限制性核酸內(nèi)切酶及其應用二DNA連接酶及其應用三DNA聚合酶及其應用四修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.

第3頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類和命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應一限制性核酸內(nèi)切酶及其應用第4頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月50年代初發(fā)現(xiàn)了由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象(K)(B)大腸桿菌B大腸桿菌K1110—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)E.coliC100%第5頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月限制—修飾的酶學假說(B)(B)酶切位點不被修飾噬菌體DNA被切割酶切位點被修飾Methylation基因組DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan從大腸桿菌K和B中發(fā)現(xiàn)了I型限制性核酸內(nèi)切酶；1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離純化了第一個II型限制性核酸內(nèi)切酶HindII，使得DNA分子的體外精確切割成為可能。KKBB第6頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶的概念

限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonucleases）：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并能精確特異地切割雙鏈DNA分子的核酸內(nèi)切酶。已經(jīng)從近300中微生物中分離出了500余種限制性核酸內(nèi)切酶。2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名第7頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶的分類1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結構3.限制輔助因子4.切割位點5.特異性切割6.基因克隆中I型單一多功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點1000bp不是無用II型限制酶和修飾酶分開單一成分Mg2+特異性位點及其附近是非常有用III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點3‘端24-26bp處是有用第8頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個字母（大寫）和種名的頭兩個字母（小寫）組成3個斜體字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichiacoli

表示為Eco,流感嗜血菌Hemophilusinfluenzae

表示為Hin；2、用一個正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則用羅馬數(shù)字標出，比如EcoRI、HindIII。第9頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月EEscherichia(屬)cocoli(種)RRY13(品系)I首先發(fā)現(xiàn)在此類細菌中發(fā)現(xiàn)的順序第10頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月3.II型限制性核酸內(nèi)切酶的3大特點1、識別位點的特異性每種酶都有其特定的DNA識別位點，通常是由4、5、6或7個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。2、識別序列的對稱性

靶序列通常具有雙重旋轉對稱的結構，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結構。3、切割位點的規(guī)范性

雙鏈DNA被酶切后，分布在兩條鏈上的切割位點旋轉對稱（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。第11頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月與II型核酸內(nèi)切酶有關的幾個概念粘性末端

cohesive

ends因酶切位點在兩條DNA單鏈上不同（對稱）酶切后形成的具有互補堿基的單鏈末端結構，酶切產(chǎn)生的兩個粘性末端很容易通過互補堿基的配對而重新連接起來。平末端

Bluntend因酶切位點在兩條DNA單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結構，這種末端不易重新連接起來。同位酶識別相同序列的酶稱為同位酶。同裂酶

isoschizomers能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同內(nèi)切酶。（切割位點不同）（同序同切酶、同序異切酶）同尾酶

isocaudamers識別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。注意：由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。第12頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月幾種II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

第13頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

經(jīng)同尾酶消化的DNA末端連接示意圖5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’BamHI5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’BglII5’XXXXA

GATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAG

AXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII第14頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

推測酶切割位點出現(xiàn)的頻率對于推斷DNA酶切片段大小很有用。假定4種核苷酸在DNA分子上出現(xiàn)的頻率相同，那么靶序列為6個核苷酸的內(nèi)切酶在每46（=4096）個核苷酸中酶切位點就有一次出現(xiàn)機會。據(jù)此推算，一條49000bp長的DNA中有12個6核苷酸識別序列的酶切位點（49000/4096）。但事實上并非真正如此，因為DNA分子中4種堿基的出現(xiàn)頻率并不均等。識別位點在DNA分子上出現(xiàn)的頻率第15頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

一個酶活單位（U）指：在理想的反應條件（適宜的緩沖液和反應溫度，通常為37℃）下，50L反應體系中完全降解1gDNA所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：A。DNA的純度和甲基化程度B。甘油的含量（不超過5%）C。反應體系中的離子強度D。反應體系的pH值F。反應的溫度條件（通常為37℃

）酶單位的定義和影響酶活性的因素Buffer(10X)2.0

LWater16.5

LDNA1.0

LEnzyme0.5

LVolume20.0

L

4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應第16頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月酶切反應的基本步驟＋－電泳紫外分析37℃1h加反應液CKMBuffer(10X)2.0

LWater16.5

LDNA1.0

L（1

g/

L）Enzyme0.5

LVolume20.0

L

1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT第17頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶的應用用于轉基因后轉化子的鑒定用于分子標記（RFLP）分析遺傳多樣性用于構建基因庫（Genomewalker）第18頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1、DNA連接酶作用的特點2、DNA連接酶的反應條件3、DNA連接的策略二DNA連接酶及其應用第19頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

環(huán)形DNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學家相信一定有一種能連接這種Nick的酶存在。

1967年，世界上幾個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條

DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶——DNA連接酶（ligase）。DNA連接酶由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能源輔助因子；T4DNA連接酶

由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，以ATP作為能源輔助因子。（1970年）容易制備，而且可以連接完全配對的平末端DNA分子，所以在基因克隆中應用廣泛。NickNick1、DNA連接酶作用的特點第20頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶作用的特點A.連接的兩條鏈必須分別具有3′端自由羥基（-OH）和5′端磷酸基團（-P），而且只有這兩個基團彼此相鄰時才能進行連接反應；B.在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程，因此連接反應必須有能量分子的參與，通常有兩種能量分子，即ATP和NAD+。OKNO第21頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月連接酶的酶活單位（U）：以T4DNA連接酶命名，在最佳的緩沖體系及15℃、1h之內(nèi)，在10~15μL反應體系中完全連接1μgλDNA的HindⅢ片段所需的酶量，稱為1U。第22頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月載體去磷防止自連的應用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH連接酶連接酶連接酶堿性磷酸酶2Pi寄主修復缺口載體自連或產(chǎn)生二具體等第23頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月2.DNA連接反應的條件

連接反應最佳溫度為37℃，但是此時粘性末端間氫鍵結合不夠穩(wěn)定，而且酶活性也會迅速降低。比如，EcoRI粘性末端連接部位只有4個堿基對，很容易斷開。所以通常在4-15℃連接。影響連接效率的因素有：A.溫度（最主要的因素）B.ATP的濃度(1M-10M)C.連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）D.反應時間（通常連接過夜）E.插入片段和載體片段的摩爾比轉化4℃過夜加反應液CK-重組菌落CK+第24頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月粘性末端DNA片段的連接NickNick3、DNA連接的策略第25頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月平末端DNA片段的末端加尾連接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’AAAAA3’3’5’5’TTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶第26頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月平末端DNA片段加接頭連接法

銜接物(linker)，也叫接頭，是由人工化學合成的一段10-12個核苷酸的DNA雙鏈，其中包含有1個或幾個限制性酶切位點。使用時只須將銜接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后用T4DNA連接酶進行連接，就可獲得能產(chǎn)生粘性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4連接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第27頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月當不同的酶產(chǎn)生的黏性末端不能互補配對時如何連接？第28頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月連接酶的應用DNA的重組加接合適的接頭第29頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)基因操作的工具酶一限制性核酸內(nèi)切酶及其應用二DNA連接酶及其應用三DNA聚合酶及其應用四修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.第30頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉錄酶（反轉錄酶）三DNA聚合酶及其應用第31頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

大腸桿菌DNA聚合酶I

（E。ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先從大腸桿菌E。Coli細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括3

種不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性以雙鏈DNA為模板，催化單核苷酸結合到引物的3′-OH末端，并不斷延伸。5′-3′外切酶活性將雙鏈DNA中游離的5′末端逐個切去。3′-5′外切酶活性將游離的雙鏈或單鏈DNA的3′端降解。不過對于雙鏈的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T第32頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

大腸桿菌DNA聚合酶I的三種用途A.制備高比活度的DNA探針

利用其5′3′的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA連接后的大缺口填充

利用5′3′的聚合酶活性。C.用于DNA的序列分析

利用5′3′的聚合酶活性。第33頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

大腸桿菌聚合酶I的應用示例CCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+切口平移(Nicktranslation)CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCT第34頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉錄酶（反轉錄酶）三DNA聚合酶及其應用第35頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

Klenow片段的主要用途Klenow片段大腸桿菌聚合酶I全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，它仍然有5′3′的聚合酶活性和3′5′的核酸外切酶活性，但失去了5′3′的外切酶活性。Klenow片段的主要用途修補限制性酶消化DNA形成的3′隱蔽末端標記DNA片段的末端cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成DNA序列的測定GAACTTAA第36頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4、T7DNA聚合酶4、逆轉錄酶（反轉錄酶）三DNA聚合酶及其應用第37頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

T4、T7DNA聚合酶的特點

T4DNA聚合酶是從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，它和大腸桿菌聚合酶I一樣具有5′3′的聚合酶活性、5′3′的外切酶活性和3′5′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶I的活性高200倍。

T7DNA聚合酶是從T7噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，T7DNA聚合酶是所有DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強的一種酶，其3′5′的核酸外切酶活性是KlenowDNA聚合酶的1000倍。T7DNA聚合酶可以替代T4DNA聚合酶的功能并能用于大片斷的擴增。第38頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

T4DNA聚合酶的用途1、以填充反應標記有5′端延伸的雙鏈

DNA片段；2、以取代反應標記延伸末端或平頭末端的雙鏈DNA片段；3、用于DNA序列分析；第39頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月耐熱的DNA聚合酶耐熱的DNA聚合酶是在高溫下具有活性的DNA聚合酶，來自嗜高溫的細菌主要用于PCR反應，如TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶等。第40頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉錄酶（反轉錄酶）三DNA聚合酶及其應用第41頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

逆轉錄酶—Reversetranscriptase逆轉錄酶是

一種可以有效地將mRNA轉錄成為DNA的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA(complementaryDNA).實際上，它也是一種RNA依賴的DNA聚合酶。逆轉錄酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。這兩個課題組的論文都發(fā)在了同一期的《Nature》雜志上。主要用途是

將mRNA轉錄成cDNA以制備基因片段。3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

第42頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)基因操作的工具酶一限制性核酸內(nèi)切酶及其應用二DNA連接酶及其應用三DNA聚合酶及其應用四修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.第43頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1、末端轉移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）4、堿性磷酸化酶四修飾性工具酶第44頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月末端轉移酶的特性末端轉移酶是一類不依賴于DNA模板的DNA聚合酶。該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下，將核苷酸連接到DNA的在3‘羥基，特別是對于平末端的雙鏈DNA末端加尾十分有效。最常見的用途是在酶切產(chǎn)生的平末端加尾以便于創(chuàng)造粘性的互補末端。第45頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月平末端DNA片段的末端加尾連接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶第46頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1、末端轉移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）3、堿性磷酸化酶（Alkalinephosphatase）四修飾性工具酶第47頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

核酸酶SI的特性

這是一種從米曲霉（Aspergillusoryzae）中分離的可以降解單鏈DNA或RNA的外切酶。其主要用途有（降解單鏈核酸）A、在cDNA合成過程中，切開cDNA的發(fā)夾末端；B、載體構建過程中，切去DNA片段的單鏈尾巴，形成平末端結構。第48頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

發(fā)夾結構的切除TTAAAATT單鏈尾巴的切除第49頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月1、末端轉移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）3、堿性磷酸化酶四修飾性工具酶第50頁，課件共60頁，創(chuàng)作于2023年2月

堿性磷酸化酶的特性

從細菌中分離的堿性磷酸化酶簡稱BAP（BacterialAlkalinePhosphatase），從小牛腸中分離的簡稱CAP（CalfAlkalinePhosphatase）.其主要功能是將DNA或RNA5′端的磷酸切除。其主要用途有：A、在用P標記DNA5′端之前，去除5′端的磷；B、在DNA重組技術中，去除