廣東蟲草多糖脫蛋白及凝膠滲透色譜分析

廣東蟲草多糖脫蛋白及凝膠滲透色譜分析

近年來，廣東微生物研究所發(fā)現(xiàn)了一種新模式。其中，活性茶多酚是一種具有創(chuàng)新價(jià)值的潛在藥物資源。利用水提醇沉法得到的蟲草多糖含有一定量的蛋白質(zhì),脫除其中的蛋白質(zhì),是對(duì)多糖進(jìn)行分離純化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。目前,對(duì)粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理的方法主要有Savage法、三氯乙酸(TCA)法、三氟三氯乙烷法、鹽酸法、酶法等,但由于各種活性多糖的自身特性不同,所適用的蛋白脫除方法也不盡相同。因此,為了提高蛋白脫除效率、減少多糖損耗,有必要對(duì)廣東蟲草多糖的脫蛋白方法進(jìn)行研究。此外,一般脫蛋白后的活性多糖組成仍較復(fù)雜,往往含有多個(gè)不同分子量級(jí)別的多糖組分。研究表明,不同分子量級(jí)別的多糖在生物學(xué)活性方面也有一定差異,因此獲取多糖的分子量分布信息至關(guān)重要。本文采用凝膠滲透色譜(GPC)法對(duì)廣東蟲草多糖的分子量分布進(jìn)行表征,以獲取各級(jí)別分子量分布的信息,從而為多糖在進(jìn)一步純化過程中選取適用的分離純化方法提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1血清白蛋白和陰離子交換樹脂廣東蟲草菌絲體由廣東省微生物研究所提供;無水乙醇、石油醚、濃硫酸、重蒸苯酚、正丁醇、氯仿、三氯乙酸、濃鹽酸、葡萄糖、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀等,均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白為國(guó)產(chǎn)生化試劑;717陰離子交換樹脂杭州爭(zhēng)光樹脂有限公司;葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(DextranStandard)系列:dxt1400Wa(Mw=1,482,000)、dxt670Wa(Mw=668,000)、dxt410Wa(Mw=410,000)、dxt270Wa(Mw=273,000)、dxt150Wa(Mw=148,000)、dxt50Wa(Mw=48,600)、dxt25Wa(Mw=23,800)、dxt12Wa(Mw=11,600)、dxt5Wa(Mw=5,200),Sigma公司。1.2儀器、試藥和儀器FW-100型高速萬能粉碎機(jī)天津市華鑫儀器廠;BS200S型電子天平德國(guó)SatRorous公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;KDC-40型低速離心機(jī)科大創(chuàng)新股份有限公司;UV-2102PC型紫外可見光分光光度計(jì)上海UNICO公司;KQ-250VDB型三頻數(shù)控超聲波清洗器江蘇昆山市超聲儀器有限公司;HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;DZF-6050型真空干燥箱上海博訊科技公司。凝膠滲透色譜(GPC)系統(tǒng):Waters1525BinaryHPLCPump、Waters717plusAutosampler、Waters2414RefractiveIndexDetector,Waters公司;數(shù)據(jù)處理系統(tǒng):Breeze(V3.3)GPC工作站。1.3水溶液多糖的提取廣東蟲草菌絲體干品,經(jīng)粉碎、過篩(100目)后得菌絲體粉末。稱取該粉末10.0g,先后用石油醚、無水乙醇回流脫脂,所得殘?jiān)贸暡ㄝo助提取其中的水溶性多糖,提取條件為:料液比(g/mL)1:20,水浴溫度60℃,提取時(shí)間30min/次,提取三次。合并提取液,蒸發(fā)濃縮后定容至300mL,冰箱中保存?zhèn)溆谩?.4方法1.4.1多酚測(cè)定采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖液中的多糖含量。1.4.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定多糖液中的蛋白質(zhì)含量。1.4.3蛋白脫除率和多糖損失率的測(cè)定取100mL多糖樣品液,加入Sevage試劑(V氯仿:V正丁醇=4:1)20mL,混合后劇烈振搖20min,4000r/min離心10min,棄去下層有機(jī)相以及中間層蛋白質(zhì)與Sevage試劑生成的凝聚物,收集上清液,定容至100mL,測(cè)定上層清液的多糖含量及蛋白質(zhì)含量。取6份樣品,Sevag法分別處理1~6次。按下列公式計(jì)算蛋白脫除率和多糖損失率:式中,R0為原多糖液中蛋白質(zhì)的初始含量;Ri為第i份多糖液脫蛋白后蛋白質(zhì)的含量。式中,T0為原多糖液中多糖的初始含量;Ti為第i份多糖液脫蛋白后多糖的含量。1.4.4三氯乙酸分光光度法取多糖樣品液50mL各6份,分別加入質(zhì)量濃度為1g/mL、2g/mL、3g/mL、4g/mL、5g/mL、6g/mL的三氯乙酸(TCA),混勻后靜置過夜,4000r/min離心10min,收集上清液,定容50mL,分別測(cè)定上清液中的多糖含量、蛋白質(zhì)含量。蛋白脫除率和多糖損失率按公式(1)和(2)計(jì)算。1.4.5多糖含量測(cè)定取多糖樣品液50mL各6份,分別用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)其pH值至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0,放置過夜,4000r/min離心10min,棄去沉淀收集上清液,定容50mL,測(cè)定上清液中的多糖含量及蛋白質(zhì)含量。蛋白脫除率和多糖損失率按公式(1)和(2)計(jì)算。1.4.6psv法表示廣東草的糖含量1.4.6.標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備色譜條件:色譜柱TOSOH公司TSK-GELG-5000PWxLcolumn(7.8mm×300mm)與TSK-GELG-3000PWxLcolumn(7.8mm×300mm)串聯(lián);流動(dòng)相0.02mol/LKH2PO4溶液,pH6.0;流速0.6mL/min;柱溫35℃;進(jìn)樣量20μL。將1.1所述的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品系列分別用流動(dòng)相配成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品液,進(jìn)樣量為20μL,采集色譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的對(duì)數(shù)lgMw為縱坐標(biāo),保留時(shí)間tR為橫坐標(biāo),繪制“l(fā)gMw—tR”曲線,用BreezeGPC系統(tǒng)軟件對(duì)曲線進(jìn)行n次回歸擬合(n=1~5),得出與曲線相關(guān)度較好的葡聚糖GPC校正曲線方程。1.4.6.固體多糖色譜的制備比較1.4.3~1.4.5所述廣東蟲草多糖脫蛋白方法,選擇最佳脫色方法對(duì)蟲草多糖液進(jìn)行脫蛋白處理。蛋白脫除干凈的蟲草多糖液用717陰離子交換樹脂脫色,真空濃縮之后透析24h。向多糖透析液中加入無水乙醇,調(diào)節(jié)醇濃度(體積分?jǐn)?shù))為75%,冰箱中醇沉過夜,所得醇沉物50℃下真空干燥成固體樣品。用流動(dòng)相將固體多糖樣品配成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的樣液,高速離心(10,000r/min,10min)后,取1.0mL上清液,過0.45μm水相微孔濾膜后按照1.4.6.1所述色譜條件,進(jìn)樣量為20μL,采集色譜圖。根據(jù)1.4.6.1所得葡聚糖GPC校正曲線方程,利用BreezeGPC系統(tǒng)軟件分析蟲草多糖的GPC譜圖,計(jì)算出蟲草多糖各組分的重均分子量Mw、數(shù)均分子量Mn、峰位分子量Mp、多分散性PD及相對(duì)含量。2結(jié)果與分析2.1sevage試劑對(duì)小鼠多糖脫除率和多糖損失率的影響Sevag法脫蛋白對(duì)多糖液中蛋白質(zhì)脫除率及多糖損失率的影響見圖1。由圖1可以看出,隨著Sevage法脫蛋白次數(shù)的增加,多糖液中蛋白質(zhì)的脫除率逐漸增加,但多糖的損失率也隨之急劇增大。蛋白的脫除率和多糖的損失率在Sevage試劑處理6次時(shí)均達(dá)到最大值,分別為80.75%和53.18%。從圖中還可以看出,脫蛋白次數(shù)達(dá)到3次以后,多糖液中蛋白的脫除率增加趨于平緩,而多糖損失率卻仍急劇上升。綜合考慮蛋白脫除率和多糖損失率,可以確定采用Sevage法脫蛋白時(shí),處理3次時(shí)效果最佳,此時(shí)蛋白脫除率和多糖損失率分別為76.66%和31.31%,所得多糖液中的蛋白質(zhì)含量為2.89%。2.2tca對(duì)多糖液的脫除率和多糖損失率的影響三氯乙酸(TCA)法脫蛋白對(duì)多糖液中蛋白質(zhì)脫除率及多糖損失率的影響見圖2。由圖2可以看出,采用TCA法脫蛋白時(shí),隨著TCA濃度的增大,多糖液的蛋白脫除率和多糖損失率均呈現(xiàn)先減后增,最后又減少的變化趨勢(shì),并且蛋白的脫除率和多糖的損失率總體均較低。綜合考慮蛋白脫除率和多糖損失率,從圖2可以確定,采用4%的TCA處理多糖液時(shí)效果最佳,此時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白脫除率和多糖損失率分別為27.94%和2.01%,處理后多糖液中蛋白質(zhì)含量為4.90%。2.3ph值對(duì)多糖液多糖脫除率和多糖損失率的影響鹽酸法脫蛋白對(duì)多糖液中蛋白質(zhì)脫除率及多糖損失率的影響見圖3。由圖3可以看出,采用鹽酸法脫蛋白時(shí),隨著多糖液pH值的升高,多糖液中蛋白脫除率和多糖損失率均呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)。綜合考慮蛋白脫除率和多糖損失率,我們從圖3可以得出,用鹽酸將多糖液的pH值調(diào)節(jié)為2.0時(shí)脫蛋白效果較理想,此時(shí)的蛋白脫除率和多糖損失率分別為48.72%和21.79%,所得多糖液中的蛋白質(zhì)含量為4.58%。2.4煙草多糖的脫除率及損失率結(jié)合圖1、圖2及圖3,我們可以看出,采用Savage法、TCA法以及鹽酸法脫除廣東蟲草多糖中的蛋白時(shí),Savage法的蛋白脫除率總體最高,鹽酸法次之,TCA法最低,而多糖的損失率則恰恰相反。因此要獲取純度較高的多糖樣品時(shí),宜采用Savage法,但必須對(duì)脫蛋白的條件進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)一步提高蛋白的脫除率并最大限度地降低多糖的損失率。2.5gpc校正曲線由1.4.6.1所述方法繪制的葡聚糖GPC校正曲線見圖4。由圖4可知,葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的GPC校正曲線方程為lgMw=-0.0027t3R+0.2187tR2-6.0548tR+61.551(tR為保留時(shí)間),曲線相關(guān)系數(shù)r=0.9997。2.6廣東菌株多糖gpc的分離和測(cè)定經(jīng)1.4.6.2所得的廣東蟲草多糖GPC譜圖見圖5(圖中保留時(shí)間tR32min~45min出現(xiàn)的色譜峰為樣品中未知小分子雜質(zhì)引起的雜峰),GPC譜圖分析結(jié)果見表1。由圖5和表1可知,經(jīng)Sevage法脫蛋白處理完全的廣東蟲草多糖(CGP)共含有三個(gè)組分:CGP-Ⅰ、CGP-Ⅱ和CGP-Ⅲ。采用GPC法測(cè)得三者的重均分子量Mw分別為2.57×106、3.84×104及5.00×103,三者的相對(duì)含量分別為57.87%、29.98%和12.14%。從PD值可以看出,蟲草多糖中的中等分子量組分CGP-Ⅱ和小分子量組分CGP-Ⅲ的PD都接近于1,表明這二者的分子量分布較均勻,而蟲草多糖中的大分子量組分CGP-Ⅰ的PD遠(yuǎn)離1,表明其分子量分布較寬,分子量的均勻性略差。3復(fù)合脫蛋白及多糖組成的優(yōu)化在對(duì)廣東