流感疫苗生產(chǎn)及研究進展

流感疫苗生產(chǎn)及研究進展

內(nèi)容病毒性滅活疫苗概述1流感和流感病毒2流感疫苗生產(chǎn)工藝33流感疫苗研發(fā)44病毒性滅活疫苗概述定義及分類病毒接種和培養(yǎng)采用物理或化學(xué)的方式將病毒滅活其他的生產(chǎn)步驟成品培養(yǎng)基質(zhì)流感疫苗：雞胚出血熱及森腦疫苗：原代地鼠腎細胞狂犬疫苗：Vero細胞滅活方法：加熱滅活劑（福爾馬林等）純化：純化全病毒疫苗裂解：裂解疫苗亞單位：亞單位疫苗純化全病毒疫苗：凍干人用狂犬病疫苗出血熱、森腦----含氫氧化鋁佐劑裂解：流感病毒裂解疫苗滅活疫苗：稱死疫苗，是指利用加熱或甲醛等理化方法將人工大量培養(yǎng)的完整的病原微生物殺死，使其喪失感染性和毒性而保持免疫原性，并結(jié)合相應(yīng)的佐劑而制成的疫苗。長春公司的病毒性滅活疫苗

工藝流程名稱病毒培養(yǎng)病毒純化病毒裂解病毒滅活半成品配制及分包裝凍干人用狂犬病疫苗基質(zhì)：Vero細胞培養(yǎng)方式：生物反應(yīng)器超濾濃縮；柱層析（分子篩）無滅活劑：β-丙內(nèi)酯凍干雙價腎綜合征出血熱疫苗森林腦炎滅活疫苗基質(zhì)：原代地鼠腎細胞方式：轉(zhuǎn)瓶超濾濃縮；柱層析（分子篩）無滅活劑：甲醛含鋁佐劑流感病毒裂解疫苗基質(zhì)：雞胚方式：孵化間超濾濃縮；蔗糖密度區(qū)帶離心裂解劑：TritonX-100滅活劑：甲醛無硫柳汞兩種滅活劑的比較簡要介紹滅活機理優(yōu)缺點甲醛甲醛，化學(xué)式HCHO，稱蟻醛。無色氣體，有特殊的刺激氣味，對人眼、鼻等有刺激作用。既可作用于病毒含氨基的核苷酸堿基（如A,G,U），又可作用病毒殼蛋白。1）病原體蛋白的抗原性嚴(yán)重破壞，可能有病原體存活；2）滅活時間長；3）易受溫度、pH、濃度、是否存在有機物、病原體的種類和含氮量等因素影響；4）殘留的游離甲醛，注入機體后，會產(chǎn)生制激性反應(yīng)。β-丙內(nèi)酯一種雜環(huán)類化合物(C3H4O2)，沸點155℃，常溫下是無色粘稠狀液體，對病毒具有很強的滅活作用。作用于病原體DNA或RNA，改變病毒核酸結(jié)構(gòu)達到滅活目的，而不直接作用于蛋白。

1）不破壞病毒的血凝素抗原,保持病毒良好的免疫原性；2）滅活時間短；3）其水解產(chǎn)物對機體無害，接種反應(yīng)輕。常用的裂解劑簡要介紹機理TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚,是一種非離子型表面活性劑（或稱去污劑）它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對細胞膜的通透性。TritonN-101聚乙二醇(壬基苯基)醚,是一種非離子型表面活性劑（或稱去污劑）溶解脂質(zhì)

CTAB十六烷基三甲基溴化銨,陽離子表面活性劑，是一種陽離子去污劑與非離子及兩性離子表面活性劑有良好的配位性，對多種油脂具較好的乳化作用,有輕微脫脂作用.流行性感冒（Influenza）即流感，是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病。常造成不同程度的流行，對人類的健康造成巨大的威脅。慢性病惡化、繼發(fā)感染、其它……-痛苦不堪-缺課或缺勤-就醫(yī)-使用抗生素-住院-死亡流感流感和流感病毒流感的流行特點是在短期內(nèi)突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行，局部暴發(fā)流行及散發(fā)。具有一定的季節(jié)性：溫、寒帶地區(qū)常在冬、春季節(jié)流行，但熱帶和亞熱帶地區(qū)任何季節(jié)都可以流行。流感病毒傳播迅速、流行廣泛、抗原易變異，人群的特異性免疫狀況不穩(wěn)定。發(fā)病率高，并伴有一定的死亡率。最高的為青少年，高危人群為年邁體弱或帶有慢性疾病患者。每次流感流行后在人群中總要造成不同程度的超額死亡。流感患者和隱性感染者是流感的主要傳染源。從潛伏期末到發(fā)病的急性期（約7天）都有傳染性。死亡率升高超過一定的正常臨界水平流感病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)流感病毒的超細微結(jié)構(gòu)照片流感病毒電鏡照片流感病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)

甲型流感病毒基因組各節(jié)段的大小與功能節(jié)段長度（bp）編碼蛋白主要功能RNAI2341PB2RNA轉(zhuǎn)錄酶；識別和結(jié)合來源于宿主細胞的帽子RNA22320PB1RNA轉(zhuǎn)錄酶主要成分；啟動轉(zhuǎn)錄和RNA合成延伸RNA32233PA具有解旋酶話性RNA41778HA結(jié)合靶細胞受體，誘導(dǎo)病毒與靶細胞融合誘導(dǎo)中和抗體，凝集紅細胞RNA51565NP與基因組RNA結(jié)合，參與形成核糖核蛋白（RNP）顆粒RNA61413NANA活性；水解細胞多糖受體，協(xié)助新生病毒顆粒從被感染宿主細胞表面游離下來，促使子代病毒釋放RNA71027M1、M2病毒基質(zhì)膜蛋白，有保護作用；質(zhì)子通道作用RNA8890NS1、NS2非結(jié)構(gòu)蛋白，抑制宿主細胞蛋白合成或參與

vRNA合成流感病毒的理化特性

流感病毒對熱敏感，通常56℃30min被滅活，但有些毒株56℃90min被滅活。

最適PH為7.0-8.0可被紫外線滅活因其為帶囊膜的病毒，故對乙醚、氯仿、丙酮等有機溶劑敏感。流感病毒的變異原因：流感病毒結(jié)構(gòu)特點天然宿主的廣泛存在密切接觸方式：抗原漂移（Antigenicdrift）

--小變異，同一亞型

--基因點突變所致

--引起流行抗原轉(zhuǎn)換（Antigenicshift）

--大變異

--基因片段交換

--引起大流行抗原漂移（AntigenicDrift）RNASialicacidAntibodiesHemagglutininNeuraminidaseHA和/或NA基因的點的變異頻繁發(fā)生A型和B型發(fā)生抗原轉(zhuǎn)換（Antigenicshift)人類和動物毒株的RNA發(fā)生交換(HA和/或NA基因的全球性變異),導(dǎo)致新的亞型出現(xiàn)少見但后果嚴(yán)重只在A型出現(xiàn)191819401960198020002020H1N1H2N2H3N2H1N1H1N11918SpanishInfluenzaH1N11957AsianInfluenzaH2N21968HongKongInfluenzaH3N22009NovelInfluenzaH1N1H71980198519952005197519962002H520021997H91999流感的流行情況抗原漂移所引起的歷史上的流感流行PB1HANAPB1NANEnglJMed10.1056/nejmoa0903810甲型H1N1流感病毒4種不同來源的基因4differentgenes:北美豬流感病毒NorthAmericaswine歐亞豬流感病毒Asia/Europeswine人流感病毒Humaninfluenza禽流感病毒(非H5)Avian(Non-H5)流感的實驗室診斷流感已成為全球患病人數(shù)最多的一類疾病。接種流感疫苗是目前預(yù)防和控制流感最經(jīng)濟、最有效的手段，已被廣泛采用，并證明有效率達到70％以上。

流感疫苗目前，使用的流感疫苗是三價的，包括兩種甲型（H1N1，H3N2）和一種乙型(B)流感病毒抗原成分，應(yīng)用最廣泛的有：

滅活：Inactivatedinfluenzavaccine（IIV）：6月以上減毒：Liveattenuatedinfluenzavaccines（IAIV）：2-49歲

當(dāng)前主要應(yīng)用的疫苗種類

滅活疫苗種類和生產(chǎn)工藝全病毒疫苗裂解疫苗亞單位疫苗第一代全病毒價格較低，但副反應(yīng)較高，部分人群不適宜接種，已逐漸淘汰第二代裂解接種效果好，臨床副反應(yīng)較少，適合各年齡段人群接種第三代亞單位有效抗原含量高，更安全，價格較高滅活疫苗種類3-4月份10-11月份WHO發(fā)布毒株生產(chǎn)企業(yè)獲得和培育毒株疫苗生產(chǎn)銷售每年世界衛(wèi)生組織根據(jù)上一年流感病毒流行情況預(yù)測下一年度流感病毒流行株并向各生產(chǎn)企業(yè)發(fā)布從WHO合作實驗室獲得病毒疫苗株，并將病毒在雞胚內(nèi)培養(yǎng)，制備毒種將病毒接種到雞胚內(nèi)培養(yǎng)，收獲尿囊液，經(jīng)純化、滅活、裂解后制備成疫苗2月份9月份5-9月份12-次年4月9月-次年2月份5月-9月生產(chǎn)周期5-6個月生產(chǎn)工藝生產(chǎn)工藝單價原液制備毒種和病毒尿囊液制備毒種MOI接種量溫濕度培養(yǎng)時間通風(fēng)溫度時間顏色量選胚接種培養(yǎng)收獲純化裂解產(chǎn)品名稱檢定項目藥典標(biāo)準(zhǔn)主代種子無菌檢查無菌生長血凝滴度不低于1：320支原體檢查符合規(guī)定鑒別試驗采用交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5LgEID50/ml外源性禽白血病病毒檢測陰性外源性禽腺病毒檢測陰性工作種子無菌檢查無菌生長血凝滴度不低于1：320支原體檢查符合規(guī)定鑒別試驗采用交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5LgEID50/ml質(zhì)量控制中間產(chǎn)品質(zhì)量控制中間品檢定項目長春公司企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)病毒收獲液微生物限度<105CFU/ml沙門氏菌陰性血凝滴度≥1:160細菌內(nèi)毒素<10EU/ml蛋白含量≤3.5mg/ml病毒濃縮液蛋白含量≤10mg/ml細菌內(nèi)毒素<160EU/ml病毒純化液蛋白