紫外-可見分光光度法

第七章紫外-可見分光光度法◆學(xué)習(xí)目標(biāo)⊙◆知識要求⊙◆能力要求⊙◆知識要求1．掌握光的吸收定律概念、表達(dá)式及條件，吸光系數(shù)和吸收光譜的意義，常用定量分析方法的原理和應(yīng)用。2．熟悉紫外-可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)、吸光度測量條件的選擇、偏離光的吸收定律的主要因素。3．了解光譜分析法的分類、紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生機(jī)制、定性分析的依據(jù)和方法。案例導(dǎo)入

在夏天參加戶外活動時，如果天氣晴朗，就應(yīng)該注意保護(hù)皮膚，否則，暴露在火辣辣太陽之下的皮膚，數(shù)小時后就會出現(xiàn)紅腫、瘙癢、發(fā)熱、刺痛癥狀，數(shù)日后出現(xiàn)蛻皮現(xiàn)象，這表明太陽光中有一種光線能傷害生物細(xì)胞。科學(xué)家研究證實(shí)，這種光線是紫外線。

根據(jù)可見光、紫外光與物質(zhì)分子的相互作用建立了紫外-可見分光光度法。

根據(jù)待測物質(zhì)（原子或分子）發(fā)射或吸收的電磁輻射，以及待測物質(zhì)與電磁輻射的相互作用而建立起來的定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法，統(tǒng)稱為光學(xué)分析法。利用光譜進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法稱為光譜分析法，簡稱光譜法。

紫外-可見分光光度法：研究物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)（200~760nm）分子吸收光譜的光譜分析法第一節(jié)概述1．電磁輻射（電磁波，光）：以巨大速度通過空間，不需要任何物質(zhì)作為傳播媒介的粒子流。

波長范圍：紫外區(qū)200-400nm可見光區(qū)400-760nm一、物質(zhì)對光的選擇性吸收電磁輻射的性質(zhì)：具有波、粒二象性波動性：粒子性：第一節(jié)概述單色光:

單一波長的光束復(fù)色光:

含有多種波長的光束電磁波譜:

以波長大小順序排列的電磁波譜圖波長10pm300pm200nm400nm800nm500mm1cm1m光譜射線X射線紫外光可見光紅外光微波無線電波方法

光譜法分光光度法光譜法核磁共振可見光第一節(jié)概述紅光與綠光互補(bǔ)、紫光與黃光互補(bǔ)，等等。

白光的組成白光的色散單色光復(fù)合光光的互補(bǔ)單一波長的光由不同波長的光組合而成的光若兩種不同顏色的單色光按一定的強(qiáng)度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補(bǔ)色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補(bǔ)。藍(lán)黃紫紅綠紫黃綠青藍(lán)橙紅青一、物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光第一節(jié)概述二、透光率與吸光度I0＝Ia+It+Ir

I0＝Ia+It

第一節(jié)概述透射光強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0的比值稱為透光率或透光度T透光率的負(fù)對數(shù)為吸光度A

【例題9-2】（1）透光率T為50%，其吸光度A為多少？（2）吸光度A為0.70，其透光率T為多少？解:（1）透光率T=50%=0.50,其吸光度為：A=-lgT=-lg0.50=0.30(2）吸光度A=0.70,其夠光率為：T=10-A=10-0.70=0.20=20%或0.70=-lgTlgT=-0.70,T=0.20第一節(jié)概述三、吸收光譜曲線概念：以波長λ為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)所描繪的曲線，稱為吸收光譜曲線，簡稱吸收光譜。特點(diǎn)：在相同條件下，同一物質(zhì)的不同濃度的溶液，其吸收光譜曲線相似，且λmax相同。這是定性分析的基礎(chǔ)。UV-Vis吸收光譜的常見術(shù)語吸收峰→

max谷→

min肩峰→

sh末端吸收:吸收光譜曲線波長最短的一段，吸光度相當(dāng)大，但不成峰的部分。強(qiáng)帶：吸光度大于104的吸收峰弱帶：吸光度小于103的吸收峰特征值→定性依據(jù)第一節(jié)概述吸收光譜曲線示意圖

A480520560nm

max=515第一節(jié)概述四、紫外-可見分光光度的特點(diǎn)課堂活動1．紫外-可見光的波長范圍是

A．200~400nmB．400~760nmC．200~760nmD．360~800nm2．下列敘述錯誤的是A．光的能量與其波長成反比B．有色溶液越濃，對光的吸收也越強(qiáng)烈C．物質(zhì)對光的吸收有選擇性D．光的能量與其頻率成反比第一節(jié)概述課堂活動3．紫外-可見分光光度法屬于A．原子發(fā)射光譜法B．原子吸收光譜法

C．分子發(fā)射光譜法D．分子吸收光譜法4．分子吸收可見-紫外光后，可發(fā)生哪種類型的（）分子能級躍遷A．轉(zhuǎn)動能級躍遷B．振動能級躍遷

C．電子能級躍遷D．以上都能發(fā)生

第一節(jié)概述第一節(jié)概述點(diǎn)滴積累1．光的本質(zhì)是電磁波；物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。2．吸光度與透光率的關(guān)系是:3．吸收曲線是溶液在一定條件下的吸光度隨入射光波長變化而變化的曲線。

二、Lambert-Beer定律I0Itl光的吸收定律A＝-lgT=lg（I0/It)=kclA：吸光度T：透光率，T=It/I0l：液層厚度(光程長度)c：溶液的濃度k：吸光系數(shù)朗伯(Lambert)定律：A=K1L比耳(Beer)定律：A=K2c

單色光適用范圍：可見光、紫外光和紅外光；均勻無散射的溶液、固體和氣體。

I0=It+IaA＝-lgT=klc吸收光譜法的基本定律，是定量測定的依據(jù)A與c為簡單的正比關(guān)系；T與c是指數(shù)關(guān)系A(chǔ)具加合性設(shè)共存物為a、b、c，則：A=kalca+kblcb+kclcc1．Lamber-Beer定律的適用條件（前提）入射光為單色光溶液是稀溶液

1、物理意義：指吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時的吸光度

2、不同物質(zhì)對同一波長的單色光，有不同的吸光系數(shù)，k↑，物質(zhì)對光的吸收能力↑。吸光物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)，是定性和定量的依據(jù)。

3、表示方法：k值及單位與c和l采用的單位有關(guān)εmax表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，它的大小反映了光度法測定某物質(zhì)可能達(dá)到的靈敏度。

ε>104

靈敏度高104>ε>103

靈敏度中等ε<103

靈敏度低二、吸光系數(shù)2、比吸光系數(shù)（百分吸光系數(shù)）

在某一波長下，溶液濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時的吸光度。單位：L/(mol·cm)在某一波長下,溶液濃度為1（g/100ml)、液層厚度為1cm時的吸光度。單位：mL/(g·cm)1、摩爾吸光系數(shù)ε吸光系數(shù)的大小，取決于物質(zhì)（溶質(zhì)、溶劑）本性、溫度和光的波長。1）物質(zhì)不同，吸光系數(shù)不同，是物質(zhì)的特征常數(shù)；2）溶劑不同，同一物質(zhì)吸光系數(shù)不同，故常在描述吸光系數(shù)時需指明某溶劑；3）光的波長不同，吸光系數(shù)不同。某化合物的濃度為4.2×10-3g/L，用2.0cm的吸收池在470nm下測得的透光率為30.0%，該化合物的分子量為250，求其在470nm處的摩爾吸光系數(shù)和百分吸光系數(shù)。例：解：∵A=-lgT=-lg0.300=0.523c=4.2×10-3g/L=4.2×10-4g/100mll=2.0cm課堂互動某有色溶液的物質(zhì)的量濃度濃度為c，在一定條件下用1cm比色杯測得吸光度為A，則摩爾吸光系數(shù)應(yīng)為：A．cAB．cMC．A/CD．C/A第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理五、偏離Lambert-Beer定律的因素（一）化學(xué)因素吸光物質(zhì)溶液的濃度稀溶液吸光性物質(zhì)的化學(xué)變化溶劑的影響A＝εlc（二）光學(xué)因素(1)非單色光l對策：選擇比較好的單色器入射波長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波長處嚴(yán)格地講，吸收定律只適用于單色光。單色光指具有單一波長的光，但實(shí)際上不能得到純粹的單色光，而是波長范圍較窄的復(fù)合光。對于同一物質(zhì)對不同波長的光的吸收程度不同，所以導(dǎo)致對光的吸收定律的偏離。(2)雜散光：單色光中混有一些不在譜帶寬度范圍內(nèi)、與所需的波長不符的光，稱為雜散光(3)散射和反射光(4)非平行光吸收質(zhì)點(diǎn)的散射（膠體、乳濁液或懸濁液）吸收池內(nèi)外界面的反射測得的吸光度偏高l用參比溶液(空白溶液)對比補(bǔ)償對策：第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理點(diǎn)滴積累1．光的吸收定律表明了吸光度與液層厚度和濃度之間的關(guān)系，它是吸收光譜法定量分析的依據(jù)。2．吸光系數(shù)的表示方法有多種，隨待測溶液濃度的不同標(biāo)度而不同。3．偏離光的吸收定律的因素主要有化學(xué)因素和光學(xué)因素。第三節(jié)紫外-可見分光光度計(jì)一、紫外-可見分光光度計(jì)的主要部件：光源—單色器—吸收池—檢測器—訊號處理與顯示器

一、主要部件：1、光源：發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠強(qiáng)度且穩(wěn)定（不隨λ而改變）

分光光度計(jì)中常用的光源有：熱輻射光源：鎢燈，鹵鎢燈（可見、近紅外光區(qū)）

可發(fā)射340-2500nm的連續(xù)光譜氣體放電光源：氫燈，氘燈（紫外光區(qū)）發(fā)射150-400nm連續(xù)光譜氙燈氫燈鎢燈2、單色器：是從連續(xù)光譜中獲得所需波段的單色光的裝置。（1）入射狹縫:限制雜散光進(jìn)入（2）準(zhǔn)直鏡（透鏡或凹面反射鏡），它使入射光束變?yōu)槠叫泄馐?。?）色散元件：棱鏡或光柵，它使不同波長的入射光色散開來。（4）聚焦透鏡或聚焦凹面反射鏡聚焦，它使不同波長的光聚焦在焦面的不同位置。（5）出射狹縫作用：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。但狹縫↓，光強(qiáng)度↓，靈敏度↓3、吸收池（比色皿或比色杯）：用于盛放溶液并提供一定吸光厚度的器皿。它由透明的光學(xué)玻璃或石英材料組成。玻璃吸收池只能用于可見光區(qū)，而石英吸收池在紫外和可見光區(qū)都可使用。光徑一般在0.1-10cm，最常用的吸收池吸光厚度為1cm。高濃度常選光徑較小的，低濃度選光徑較大的。（四）檢測器：利用光電效應(yīng)，將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成電流訊號。（光信號→電信號）

光檢測器：光電池、光電管、光電倍增管和光二極管陣列檢測器。（五）信號顯示系統(tǒng)：將信號以適當(dāng)方式顯示或記錄。

常用的顯示器有直讀檢流計(jì)、微安表、電位計(jì)、數(shù)字電壓表、記錄儀、示波器及數(shù)據(jù)處理機(jī)等。很多型號的分光光度計(jì)裝配有微處理機(jī)，既可對分光光度計(jì)進(jìn)行操作控制，又可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。二、分光光度計(jì)的類型：（一）單波長單光束分光光度計(jì)：0.575光源單色器吸收池檢測器顯示只有一條光路，通過變換參比池和樣品池的位置，使它們分別置于光路來進(jìn)行測定國產(chǎn)751型、752型、721型、722型、UV-1100型、英國SP-500型，伯克曼DU-8型這類分光光度計(jì)的特點(diǎn)是：一般用鎢燈或氫燈作光源，結(jié)構(gòu)簡單，價格便宜。主要適用于定量分析，而不適用于作定性分析。另外，結(jié)果受電源的波動影響較大。（二）單波長雙光束分光光度計(jì)光源比值單色器吸收池檢測器顯示光束分裂器雙光束分光光度計(jì)是自動比較了透過參比溶液和樣品溶液的光的強(qiáng)度，它不受光源（電源）變化的影響。雙光束分光光度計(jì)還能進(jìn)行波長掃描，并自動記錄下各波長下的吸光度，很快就可得到試液的吸收光譜。所以能用于定性分析。國產(chǎn)710型、730型、

740型、日立UV-340型、U-4100等屬于這種類型。光源單色器Ⅰ單色器Ⅱ檢測器切光器狹縫吸收池3、雙波長分光光度計(jì)：用兩種不同波長的單色光束交替照射到樣品溶液上，不需使用參比溶液，測得的是樣品在兩種波長下的吸光度之差。一個光源，兩個單色器，一個吸收池

2

11、波長范圍2、波長準(zhǔn)確度3、波長重現(xiàn)性4、狹縫或譜帶寬5、分辨率6、雜散光7、透光率測量范圍8、吸光度測量范圍9、測光準(zhǔn)確度10、測光重現(xiàn)性三、分光光度計(jì)的光學(xué)性能第三節(jié)紫外-可見分光光度計(jì)點(diǎn)滴積累紫外-可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)相同，都由光源、單色器、吸收池、檢測器、訊號處理與顯示器等主要部件構(gòu)成，但不同型號儀器的外形差別很大，質(zhì)量和價格相差懸殊，操作方法迥異，使用之前應(yīng)仔細(xì)閱讀儀器使用說明書。

00.41.22.02.83.6246%A暗噪聲訊號噪聲誤差曲線從圖中可以看出：A值控制在0.2-0.7之間(或T值在20%-65%之間）相對誤差較小。方法：改變待測液的濃度選用適當(dāng)厚度的吸收池1.吸光度范圍的選擇第四節(jié)分析條件的選擇（一）、儀器測量條件的選擇一般應(yīng)該選擇λmax為入射光波長。如果λmax處有共存組分干擾時，則應(yīng)考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。2.選擇適當(dāng)?shù)娜肷洳ㄩL二、顯色反應(yīng)條件的選擇顯色反應(yīng)：在光度分析中將試樣中的待測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)。顯色反應(yīng)需滿足的條件：1．選擇性要好，與樣品可發(fā)生定量反應(yīng)。2．靈敏度要高：3．有色化合物的組成要恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定在紫外-可見光區(qū)有吸收，且

max較大。

4．顯色劑的顏色與有色化合物的顏色差別要大5．反應(yīng)的條件要易于控制。顯色反應(yīng)條件的控制(1)顯色劑用量生成配位化合物的顯色反應(yīng)可用下式表示：M+nR→MRn若配合物穩(wěn)定性好，顯色劑只需稍過量。若配合物不穩(wěn)定，顯色劑需過量很多。若可形成逐級配合物時，顯色劑用量應(yīng)嚴(yán)格控制在一定范圍。例：MoMo(SCN)5Mo(SCN)6-桔紅色淺紅色2、溶液的酸度pH值對顯色反應(yīng)的影響pH值不同，可形成具不同配位數(shù)、不同顏色的配合物pH值增大，引起某些金屬離子水解，甚至析出沉淀。Fe(SCN)2++OH-→Fe(OH)2++SCN-例：Fe3+與水楊酸在不同pH值生成不同配合物pH值<44-78-10配合物組成Fe(C7H4O3)+Fe(C7H4O3)2-Fe(C7H4O3)33-顏色紫紅棕橙黃pH值的確定做A-pH關(guān)系曲線，得到合適的pH值范圍（3）其他條件顯色溫度顯色時間放置時間溶劑顯色反應(yīng)的速度有快有慢，快的幾乎是瞬間完成，顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，并且能保持較長時間。大多數(shù)顯色反應(yīng)的速度是比較慢的，需要一定時間才能達(dá)到穩(wěn)定。而且有些有色化合物放置過久也會褪色。適宜的顯色時間、溫度要由實(shí)驗(yàn)來確定。三、參比溶液選擇為什么需要使用參比溶液？所測得的吸光度要真正反映待測溶液的吸光強(qiáng)度。1、溶劑參比試樣組成簡單、共存組份少(基體干擾少)、顯色劑不吸收時，直接采用溶劑(多為蒸餾水)為參比。即試劑、干擾、顯色劑均無吸收，用溶劑作參比。注：采用空白對比消除因溶劑和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素對透光率的干擾。試劑參比：當(dāng)顯色劑和其它試劑在測定波長處有吸收時，采用試劑+顯色劑作參比(不加待測物)。試樣參比：如試樣基體在測定波長處有吸收，可以試樣作參比(不能加顯色劑)。平行操作參比溶液：用不含待測組分的試樣，在完全相同條件下與待測試樣同時進(jìn)行處理，得到平行操作參比溶液。第四節(jié)分析條件的選擇點(diǎn)滴積累1．選擇吸光性物質(zhì)的最大吸收波長作為測定波長。2．使用紫外-可見分光光度計(jì)時，讀數(shù)范圍應(yīng)控制在吸光度為0.2～0.7，透光率為65%～

20%之間。3．待測物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)無吸收時，應(yīng)加顯色劑。顯色劑不得有干擾，反應(yīng)必須完全。4．一般用溶劑作參比溶液。必要時采用試樣參比溶液、試劑參比溶液或平行操作參比溶液。

第五節(jié)定性與定量分析一、定性分析依據(jù)：相同的化合物有相同的光譜方法：比較吸收光譜的一致性比較吸收光譜的特征數(shù)據(jù)比較吸光度的比值定性鑒別純度檢查和雜質(zhì)限量測定（一）定性鑒別定性鑒別的依據(jù)→吸收光譜的特征(λmax和εmax）吸收光譜的形狀吸收峰的數(shù)目吸收峰的位置（波長）吸收峰的強(qiáng)度相應(yīng)的吸光系數(shù)缺陷：不能鑒定飽和物質(zhì)及結(jié)構(gòu)相似的化合物。1．對比吸收光譜的特征數(shù)據(jù)（吸光度或吸光系數(shù)）2．對比吸光度或吸光系數(shù)的比值：如果化合物有幾個吸收峰，可用在不同吸收峰（或峰與谷）處測得吸光度的比值作為鑒別的依據(jù)。例：3．對比吸收光譜的一致性同一測定條件下，與標(biāo)準(zhǔn)對照物譜圖或標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對照比較（二）純度檢查和雜質(zhì)限量測定1．純度檢查（雜質(zhì)檢查）1）峰位不重疊：找λ→使主成分無吸收，雜質(zhì)有吸收→直接考察雜質(zhì)含量2）峰位重疊：主成分強(qiáng)吸收，雜質(zhì)無吸收/弱吸收→與純品比較，E↓雜質(zhì)強(qiáng)吸收>>主成分吸收→與純品比較，E↑，光譜變形雜質(zhì)的存在吸收曲線形狀改變吸光系數(shù)值的大小例：乙醇中含少量的雜質(zhì)苯乙醇的UV吸收光譜在256nm處沒有吸收峰而苯在256nm處有的吸收峰苯的檢出限量低達(dá)10ppm2、雜質(zhì)的限量檢查測定特定波長的吸光度值，計(jì)算雜質(zhì)的含量在此波長處，雜質(zhì)有吸收，而藥物無吸收測定兩個特定波長的吸光度的比值二、定量分析（一）單組分的定量方法1．標(biāo)準(zhǔn)曲線法2．標(biāo)準(zhǔn)對比法：外標(biāo)一點(diǎn)法3．吸光系數(shù)法1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測定吸光度。繪制A-c標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程。測定樣品的A值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上或代入回歸方程得到樣品的濃度。蘆丁含量測定0.710mg/25mL標(biāo)準(zhǔn)溶液一般為5～7個點(diǎn)，至少不少于4個。待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)平行處理。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍應(yīng)在溶液吸光度與其濃度呈線性關(guān)