第10章 富含多不飽和脂肪酸的光合微生物的調(diào)查 姜劍鋒

#W.H.ChartsiRtheMolecularSpeciesDistribution(<44(TFA)a^dContent(M9eL'JtnMGMof#?fndiatFell網(wǎng)4n勺我MOwryfr^FnN-Slorvation'.MolecularSpecr-MMflltCuliir5pcc.it-5-DistributionsndConrent*4-StarvationRtt<i￥try%TFAP旳L%IFApq/nfLCWC16132/16:2?l.35.02.610;30-3^1氐2碗2啟4.9ISlB2/16!3n-i12.52.Q4.31?1ie；J/1C;Jn-32423.925A7.7Total?曲陽B3.913437.1N3cwcia牯叮打E12trEr3.BIJlS2fl8dz.oO.i6.41.905trtr時1馭HMeTLltL)2A0J&13022.40l?liouiiByit6,11.0IM4,7czo/cia用F8d2.fl0J10.)3.14Bfla?iu*2曲/1的n-32.10l37J22TM2CU20■卅1,41U1UC2fl/catj卻豁煜CM1J00.1知2JB'Cultiu'cs□<P,inrrsflvwerekeptanN-freemetihjmforUd.Culuireiweneretuipenc^iTinfullnirfiunijiri活r血問edfaranother2dat2fl'CKJFAareafIhrfamily,ufile^ci[l-i*-rwit?n-otrd.PositionalD-na^shwa^naipMformsd.Abbrevialions!totalfattyactdilFA!traceyt.Sour轉(zhuǎn)Kttfliin-GoloWrr^etal..?M5.這些發(fā)現(xiàn)支持了我們的假說，即雪藻中富含花生四烯酸的甘油三酯的一個重要作用就是構(gòu)建富含多不飽和脂肪酸的葉綠體膜，尤其是在低溫時，多不飽和脂肪酸的從頭生物合成太慢的條件下。的確，最近人們建議，脂質(zhì)體的亞細(xì)胞作用比上述假設(shè)要復(fù)雜得多，它們相對無效的碳儲存方式。這就促使我們要對極性油脂進(jìn)行改造。在一些綠色藻類和高等植物中，葉綠體脂質(zhì)被分為兩類：原核脂類和真核脂類。在原核脂類中甘油骨架sn-2位上是C16脂肪酸，記為18/16；而在真核脂類中，兩個位置都是C18脂肪酸，記為18/18。我們的發(fā)現(xiàn)表明，在雪藻中，葉綠體油脂的產(chǎn)生有兩種途徑：第一種途徑是原核途徑，與16:3植物和少數(shù)幾種綠色藻類類似，生產(chǎn)出18/16類型的分子，也就是單半乳糖甘油二脂（或許還有其它的葉綠體脂類）。另一種途徑是原核途徑，生產(chǎn)出三種類型的分子，分別是18/18、20/18和20/20，這些分子類型看來是從1，2-二酰基甘油-0-4'-（N,N,N-三甲基）高絲氨酸和卵磷脂，還有甘油三酯衍生來的（圖10.5）?！?■=*834?Fi乎10J.冃*卍■?■=*834?Fi乎10J.冃*卍itMJtiMof閉對如yinchlnroplwticbpidi[leftscatejafldTAG(rightralrlqrfP吐沁Inthelkst48h問礙in自hiir^n刖環(huán)朗如fw皿4Irtwlingwirth[1」^lia：!fm出handniwqpfl足plefikshmerrtat河*C(Irfi冏門前呵I2TBghr(Hr>eO：TAG(EkMGDG(II.DGDG(A!-,andSCJDGl+An^specEivel/.―hcm?—*—8s)tKSTltnt(hEMiriaJlrO^?rtl>JeGhhrfiiEB4J■F4CDG*—DGEXi―*—SQM：TtatvtIhMrt?flfflillTne?FEpJEttiihaiEHrfli我們隨之對構(gòu)建葉綠體脂質(zhì)的幾種方法進(jìn)行了試驗。發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境條件不利于藻體生長的時候，例如，在穩(wěn)定期或者氮缺乏時，原核途徑占優(yōu)勢，包含了超過70%的單半乳糖甘油二脂，產(chǎn)生出諸如18:2n-6/16:2n-3的分子類型。在通常情況下，真核途徑（真核途徑I）占優(yōu)勢，而且兩種途徑的n-3去飽和途徑都會加強(qiáng)，通過原核途徑和真核途徑分別產(chǎn)生出18:3n-3/16:3n-3和18:3n-3/18:3n-3的分子類型。當(dāng)培養(yǎng)的過程中突然要求我們要加強(qiáng)去飽和途徑的時候，例如在最佳溫度條件下從缺氮培養(yǎng)中恢復(fù)過來的是時候，利用1，2-二?；视?O-4'-（N,N,N-三甲基）高絲氨酸和卵磷脂從頭合成并不能滿足需要。因為藻體的生長條件可能是瞬變的，甘油三酯能迅速的釋放富含花生四烯酸的?；糠?，并被輸送到葉綠體中生產(chǎn)20:4/20:4的分子類型（真核途徑II）（表10.H）?；ㄉ南┧峄糠值妮斎胫皇嵌虝旱?，在最佳條件下生長幾天后,葉綠體花生四烯酸就會減少到正常水平，而原核分子類型也會恢復(fù)它的優(yōu)勢地位。

CytQpl師cn\7D|g：3n-3一IS:3n-3Enl<iNoroplastn-fcDji-6D?JpeiTD初1(L2,口ullw白Ih?b?tvn4hr^d[hrwrlriiCytQpl師cn\7D|g：3n-3一IS:3n-3Enl<iNoroplastn-fcDji-6D?JpeiTD初1(L2,口ullw白Ih?b?tvn4hr^d[hrwrlrii」、吟卅叫：WhmHul.iriprri^^ofMGlXt■■P.irirrnLhil^ri^nllwfwiwPLJfAn曲Ml*h#?ihIzinlR,DOTSPCTAG^—16：IIM<ibL51LKTFjuksiryoticIIhflriri-3pmkitrytrticEiakuT^ntic另外一種藻類——紫球藻的研究結(jié)果也相類似。當(dāng)紫球藻的生態(tài)環(huán)境突然變化的時候,真核分子類型的單半乳糖甘油二脂含量由30°C時的42%增加到20°C時的58%；并且，伴隨著氮的補(bǔ)充，通過甘油三酯中花生四烯酸的輸入，產(chǎn)生了20/20分子類型的單半乳糖甘油二脂。最近,高等植物的脂質(zhì)體被證明在種子和其它植物器官中具有代謝活性。Stobart等人證明，在發(fā)育的紅花種子中，微粒體膜上存在著一個甘油三酯的酰基轉(zhuǎn)移機(jī)制。暴露在強(qiáng)光中會損害光合機(jī)制，尤其是在低溫條件下，損害的主要地方是光合系統(tǒng)II的D1蛋白質(zhì)。脂肪酸的去飽和作用對忍受強(qiáng)光非常重要，尤其在低溫時，低溫會導(dǎo)致D1蛋白質(zhì)的加速合成。雪藻的最佳生長溫度是25°C，但是從日本分離的一個藻株能經(jīng)受4C的低溫。通過測量氧氣的演化和可調(diào)的熒光，我們發(fā)現(xiàn)雪藻Pincisa比紫球藻對低溫共有抵抗力，它的低溫耐受性幾乎和極地雪藻Chlamydomonasnivalis一樣高。雙高-Y-亞麻酸產(chǎn)品雙高-Y-亞麻酸是人體許多重要具有生理活性物質(zhì)（如前列腺素、白細(xì)胞三烯）的前體，它還具有重要的藥理學(xué)意義。但是目前，我們還缺乏雙高-Y-亞麻酸來源和應(yīng)用上的研究。與其它多不飽和脂肪酸可以在高等植物、真菌和藻類積累不同，雙高-Y-亞麻酸僅僅是花生四烯酸生物合成的中間體，它在任何生物體中都不存在。并且,在人體內(nèi)，從Y-亞麻酸到雙高-Y-亞麻酸的轉(zhuǎn)換只有在特定情況下才會出現(xiàn)，如低鈣時，并且這種轉(zhuǎn)換非常少，在這種情況下，我們不能認(rèn)同Y-亞麻酸就和雙高-Y-亞麻酸一樣。唯一報道過的雙高-Y-亞麻酸的來源是被抱霉菌。雪藻中高含量的花生四烯酸提示我們，這個有機(jī)體也可以用來生產(chǎn)其它多不飽和脂肪酸。因此，我們利用N-甲基-N'肖基-N-亞硝基胍來對雪藻進(jìn)行誘變。因為花生四烯酸的一個作用就是在低溫下為細(xì)胞膜提供一個高水平的不飽和狀態(tài)，因此，我們選擇突變株的一個重要原則就是在這些條件（低溫）下，那些欠缺這種轉(zhuǎn)換能力的突變株。事實上，在這些突變株中，P127在去飽和途徑上有缺陷，它幾乎不能將雙高-Y-亞麻酸轉(zhuǎn)化為花生四烯酸。這個突變株的發(fā)現(xiàn)是因為基因上一個終止密碼子的出現(xiàn)，使得這種轉(zhuǎn)化酶的功能喪失。誘變株產(chǎn)生很少量的花生四烯酸和高含量的雙高-Y-亞麻酸，占到總脂肪酸含量的39%以上（表10.I），占細(xì)胞干重的14%，這就使之成為生產(chǎn)雙高-Y-亞麻酸的潛在菌種。誘變株中油脂的分配和野生株基本相同，但是脂肪酸組成有著明顯的差別。誘變株的脂類主要包括卵磷脂、腦磷脂、1，2-二酰基甘油-0-4'-（N,N,N-三甲基）高絲氨酸和花生四烯酸轉(zhuǎn)化而來的雙高-Y-亞麻酸。然而，在葉綠體脂類和甘油三酯中，誘變株的雙高-Y-亞麻酸含量比野生株中對應(yīng)的花生四烯酸含量低得多，在甘油三酯中，雙高-Y-亞麻酸的含量是27%，但在野生株中，花生四烯酸的含量為54%,另一方面，18:1卻由野生株的20%增加到43%。在單半乳糖甘油二脂（MGDG）和雙半乳糖甘油二脂（DGDG）兩種半乳糖脂中，雙高-丫-亞麻酸的減少是由n-3去飽和途徑的加強(qiáng)導(dǎo)致的，并最終導(dǎo)致16:3和18:3含量的增加。實際上，誘變株的單半乳糖甘油二脂和雙半乳糖甘油二脂主要由原核的18/16和真核的18/18分子種類組成，這就使n-3去飽和途徑的脂肪酸占優(yōu)勢。TiN-o汕!■MMwFray咸LlpdCUms亦wikilypc(>VT?*fMiMbUM汩12j*l41flmLi'riRAiwij、dnFNHringfnii.niFl申n.Upd.Sin^nFwfvJwldbiQdQ1iK2n-3lttrl￡JI9Jn-ijoj-rrfn-6M3PGWT32血1.?g3iu11?PUT32L?砒uW*4A_Wl1*9U}lQ&J卻l.k血[U21出152ID50M-3U251TPC.最a2IJ>11TtA44出日P12T1?Q?沁g■HJ&月2fSlIZUO和QB1.034119122I2j4UH任WTdJ(14PUT11.1陽dJ24.1414■1*^wtTT述1菌H.7□J1.1540Pijr■123DlBffibiri-T.iwfrrh才存片耳伽u^bRsn^d我們推測，野生株葉綠體脂類的雙高-Y-亞麻酸和不飽和脂肪酸的減少是由原核和真核類型1的分子種類的增加和n-3去飽和途徑的加強(qiáng)導(dǎo)致的。所以，低溫下，突變株的生長能力比野生株的低。雙高-Y-亞麻酸的生產(chǎn)率野生株中，雙高-Y-亞麻酸的含量比野生株中花生四烯酸少，而C18(主要是18:1和18:2)脂肪酸的比例則出現(xiàn)增加。這尤其重要，因為這兩種脂肪酸通常會損害雙高-Y-亞麻酸，而自身在甘油三酯中積累。這就要求我們要仔細(xì)衡量環(huán)境條件對雙高-Y-亞麻酸含量和C18/雙高-Y-亞麻酸比率的影響。氮缺乏會導(dǎo)致總脂肪酸和雙高-Y-亞麻酸含量的增加，而磷酸鹽缺乏會導(dǎo)致一些脂肪酸含量的增加和雙高-Y-亞麻酸含量的減少。另一方面，增加十倍濃度的磷促進(jìn)了生物量的增加和雙高-Y-亞麻酸含量的增加，并且，還會導(dǎo)致C18/雙高-Y-亞麻酸比率的下降。緩沖劑的加入減弱了pH的影響，并使脂肪酸含量由34%增加到42%,雙高-Y-亞麻酸的比例也由28%增加到35%,總雙高-Y-亞麻酸含量由10%增加到15%。并且，18:1和18:2的比例明顯的下降，(18:1+18:2)/雙高-Y-亞麻酸的比率更是由1.35下降到0.96。ntaN14U.EttKQf-RWGphM*CtMfiWHiMTmJ陽即站CMjL>l|口才亡皿C&rcrtiCWDGIA矗TWETT和R1昨11?Z?.9useJ3—1SJMJJU1Z?47?Ml-』l5地，449扳fuhi?iftB&M14JjrOihJjmh*苗1|.DuM7￡mM口乩er”吶iriffl訊自b阿w訊tk/^<N弟血MnWTriPHCL軒攔*叭日即DGl丄川血I■剛［中if0<yCW.dk^屯nyKkKTHLithrdt:Q^hlhfa<（hiiiiii-Cc4ifcrn^Kip^j^nh^在氮限制階段，我們研究了不同的初始氮含量的影響。發(fā)現(xiàn)，但培養(yǎng)進(jìn)行到無氮培養(yǎng)階段，18:1上升得非常明顯，而對雙高-Y-亞麻酸則有損害。然而，當(dāng)初始氮含量只有50%或25%（相對于BG11培養(yǎng)基）的時候，（18:1+18:2）/雙高-丫-亞麻酸的比率則有所改善（下降），歸因于生物量的積累，此時的雙高-Y-亞麻酸的含量也高一些。光照強(qiáng)度和生物量影響到每個細(xì)胞所受到的的光的大小。高的生物量和低光照強(qiáng)度（35yE/m2s）導(dǎo)致雙高-Y-亞麻酸含量的增加（占40%左右），然而，油脂總產(chǎn)量和雙高-丫-亞麻酸的總產(chǎn)量基本不變。在1升的一個反應(yīng)柱中，在氮缺乏和180yE/m2s的光照條件下，結(jié)果14天的培養(yǎng)，達(dá)到最大的雙高-Y-亞麻酸含量（占干重的10%），生物量為1g/L。而在相似的氮缺乏和450pE/m2s的光照條件下，達(dá)到最高的雙高-Y-亞麻酸產(chǎn)量（755mg/L），此時的生物量為2g/L。我們期待著更高的生物量和營養(yǎng)狀況的出現(xiàn)，并使雙高-Y-亞麻酸的含量和產(chǎn)量達(dá)到更高。結(jié)論按照目前流行的說法，植物積累甘油三酯來貯存能量。實際上，大多數(shù)藻類的甘油三酯大多數(shù)由飽和和單不飽和脂肪酸組成，這些脂肪酸能相對簡單的提供更多的能量。我們在對紅藻門的紫球藻（Porphyridiumcruent）進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，甘油三酯上結(jié)合的長鏈多不飽和脂肪酸能被用來生物合成