松果體、褪黑素對(duì)大鼠下丘腦crh神經(jīng)元表達(dá)的影響

松果體、褪黑素對(duì)大鼠下丘腦crh神經(jīng)元表達(dá)的影響

近年來(lái)，許多研究表明，松弛果實(shí)的藍(lán)色信號(hào)對(duì)構(gòu)建劑-石墨軸（hyp-a）的維持有顯著的調(diào)節(jié)作用，這軸上的糖皮質(zhì)激素對(duì)身體的免疫功能有顯著的抑制作用。因此，許多科學(xué)家認(rèn)為，通過(guò)調(diào)節(jié)hpa軸和免疫功能來(lái)調(diào)節(jié)免疫功能是實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)的重要手段。松果體對(duì)垂體和腎上腺影響的研究已較為深入,體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)無(wú)論從形態(tài)和功能方面都證明松果體褪黑素對(duì)HPA有調(diào)節(jié)作用,但迄今為止松果體對(duì)下丘腦影響的研究主要停留在松果體褪黑素對(duì)下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropinreleasinghormone,CRH)神經(jīng)元分泌的CRH的影響的水平上。筆者研究是為進(jìn)一步揭示松果體及褪黑素對(duì)免疫功能以及免疫相關(guān)性疾病如腫瘤、自身免疫性疾病等的影響機(jī)制提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1顆粒飼料,自由攝食,自然光照選用2月齡雄性清潔級(jí)SD大鼠100只(浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證書(shū)號(hào):2001001),體質(zhì)量(200±10)g。標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,自由攝食飲水,自然光照。隨機(jī)分為對(duì)照組(N組)、假手術(shù)對(duì)照組(Sham組)、松果體摘除組(M0組)、松果體摘除+褪黑素腹腔注射7.5mg/kg組(M1組)和松果體摘除+褪黑素腹腔注射15mg/kg組(M2組),注射時(shí)間為每天17∶00,注射后4,8周取材,M0組動(dòng)物腹腔注射等量生理鹽水。1.1.2大鼠crh原位雜交試驗(yàn)劑盒褪黑素(美國(guó)Sigma公司),羊抗CRH多克隆抗體、羊ABC染色系統(tǒng)(美國(guó)SantaCruzBiotechnology公司),大鼠CRH原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),大鼠血清CRHELISA試劑盒(美國(guó)ADR公司)。牙科渦輪高速牙床(cs181,上海齒科醫(yī)械廠(chǎng)),手搖切片機(jī)(1712,德國(guó)Leica公司),光學(xué)顯微鏡(BH2,日本Olympus公司),酶標(biāo)檢測(cè)儀(550,美國(guó)BioRad公司),數(shù)字顯微攝像系統(tǒng)(日本Nikon公司),圖像分析系統(tǒng)(JD801,南京捷達(dá)公司)。1.2方法1.2.1松果體外m0根據(jù)文獻(xiàn),2%戊巴比妥鈉麻醉(45mg/kg)后,用牙科渦輪高速牙床,以人字縫為中心五邊型磨開(kāi)顱頂諸骨后摘除松果體。Sham組動(dòng)物除不摘除松果體外,其余步驟同M0組。于術(shù)后4周和8周取全腦,10%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,取材器械及配溶液所用的雙蒸水均用DEPC處理,由于CRH神經(jīng)元主要分布在下丘腦室旁核(paraventricularnucleus,PVN)后部的小細(xì)胞群,故自前連合至乳頭體前緣(下丘腦所在范圍)行冠狀面連續(xù)切片,片厚10μm,每隔10片取1片按前后順序用APES粘片并做蘇木素-伊紅(H-E)染色,鏡下觀(guān)察選出所有室旁核后部平面的切片。1.2.2ssc的制備隨機(jī)選取每只動(dòng)物室旁核后部3張切片行原位雜交檢測(cè)CRHmRNA,雜交過(guò)程參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明。主要步驟為:3%H2O210min,3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶10min,PBS洗后入預(yù)雜交液40℃3h,入雜交液(含CRH寡核苷酸探針)40℃過(guò)夜,SSC洗滌后加封閉液37℃30min,入生物素化鼠抗地高辛37℃1h,PBS洗后入SABC37℃20min,PBS洗后加生物素化過(guò)氧化物酶37℃20min,PBS洗后DAB顯色5min,常規(guī)脫水透明封固。以預(yù)雜交液代替雜交液作為陰性對(duì)照。1.2.3水檸檬酸鹽緩沖液隨機(jī)選取每只動(dòng)物室旁核后部3張切片行ABC法檢測(cè)CRH,染色過(guò)程參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明。主要步驟為:微波修復(fù)15min(修復(fù)液為檸檬酸鹽緩沖液,pH6.0),PBS水洗后入3%H2O210min,入一抗(工作濃度1∶200)4℃冰箱過(guò)夜,PBS洗后入生物素化二抗(工作濃度1∶100)1h,PBS洗后入ABC復(fù)合物(工作濃度1∶50)30min,PBS洗后DAB顯色5min,常規(guī)脫水透明封固。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。1.2.4圖像的顯微鏡和數(shù)據(jù)處理的分析將免疫組織化學(xué)和原位雜交所獲得的切片運(yùn)用數(shù)字顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并運(yùn)用圖像分析軟件進(jìn)行定量檢測(cè)。1.2.5大鼠室旁核考察免疫組織化學(xué)和原位雜交染色均以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯黃色或黃褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá),每只大鼠共測(cè)定3張室旁核后部切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性面積和灰度,取均值。1.3ss11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)行方差分析,組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2供熱對(duì)crh陽(yáng)性細(xì)胞的影響各組的CRH陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于室旁核后部背內(nèi)側(cè)小細(xì)胞亞核,即后大細(xì)胞亞核與第三腦室之間的區(qū)域。M0組的外側(cè)小細(xì)胞亞核和腹內(nèi)側(cè)小細(xì)胞亞核也出現(xiàn)了不少陽(yáng)性細(xì)胞。CRH陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)多樣,以梭形為主,發(fā)出若干突起,免疫反應(yīng)物均勻分布于胞質(zhì)中。M0組與N組和Sham組相比,CRH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加,陽(yáng)性面積增加,平均灰度降低(P<0.05),補(bǔ)充褪黑素后呈劑量依賴(lài)性恢復(fù),M2組與M0組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),陽(yáng)性細(xì)胞主要局限于背內(nèi)側(cè)小細(xì)胞亞核和腹內(nèi)側(cè)小細(xì)胞亞核,但無(wú)論是M2還是M1組上述指標(biāo)與Sham組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。N組與Sham組比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,術(shù)后4周與術(shù)后8周的結(jié)果差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1,表1)。下丘腦室旁核CRH免疫組織化學(xué)結(jié)果提示,CRH陽(yáng)性細(xì)胞的分布、形態(tài)與原位雜交的結(jié)果相似,免疫反應(yīng)產(chǎn)物亦位于胞質(zhì),各種指標(biāo)的分析結(jié)果與原位雜交相仿(圖2,表2)。3松果體切除前后室旁核crh神經(jīng)元表達(dá)的變化松果體作為一個(gè)神經(jīng)內(nèi)分泌器官。自1980年代初Maestroni等首次發(fā)現(xiàn)褪黑素對(duì)免疫系統(tǒng)的作用以來(lái),褪黑素對(duì)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)影響的研究迅速展開(kāi)。研究發(fā)現(xiàn),松果體褪黑素能在不同層次直接或間接地影響HPA軸的功能,而HPA軸受刺激后最終分泌的糖皮質(zhì)激素對(duì)機(jī)體的免疫功能和糖代謝等有明顯的調(diào)節(jié)作用,因此松果體褪黑素可經(jīng)由HPA軸來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)或影響其它生理功能。HPA軸包括下丘腦、垂體、腎上腺三個(gè)水平,前者主要由CRH神經(jīng)元構(gòu)成,位于該軸最高點(diǎn),且涉及下丘腦室周部的重要核團(tuán)——室旁核,結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,影響因素較多,前人的研究成果有些并不一致,因此頗具研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,開(kāi)顱和結(jié)扎矢狀竇而不摘除松果體的手術(shù)刺激在術(shù)后4周后對(duì)CRH神經(jīng)元的功能沒(méi)有明顯影響。松果體摘除后大鼠下丘腦室旁核CRH原位雜交和免疫組織化學(xué)的結(jié)果與Sham組相比均顯示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多、陽(yáng)性面積增加、平均灰度降低,提示松果體摘除后室旁核CRH神經(jīng)元的表達(dá)增強(qiáng),CRH基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯均增加。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),原位雜交與免疫組織化學(xué)的結(jié)果相一致,這一點(diǎn)與其它學(xué)者在正常機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)CRH定位的研究發(fā)現(xiàn)一致。為探求松果體摘除后室旁核CRH原位雜交和免疫組織化學(xué)結(jié)果的變化是否由其分泌產(chǎn)物褪黑素分泌的銳減引起,筆者對(duì)摘除松果體的大鼠補(bǔ)充褪黑素,發(fā)現(xiàn)下丘腦原位雜交和免疫組織化學(xué)CRH染色增強(qiáng)呈劑量依賴(lài)性恢復(fù),但褪黑素應(yīng)用的兩個(gè)不同時(shí)段和兩種不同劑量均不能使CRH恢復(fù)至正常狀態(tài),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。為明確松果體及其褪黑素對(duì)下丘腦CRH神經(jīng)元的影響是否與時(shí)間因素相關(guān),本實(shí)驗(yàn)分別采用術(shù)后4周和術(shù)后8周兩個(gè)不同時(shí)期進(jìn)行取材,發(fā)現(xiàn)二者之間無(wú)顯著性差別,說(shuō)明松果體摘除以及補(bǔ)充褪黑素對(duì)下丘腦CRH神經(jīng)元的影響并未隨時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生改變,體內(nèi)也未見(jiàn)明顯的代償過(guò)程,證明術(shù)后4周是觀(guān)察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)較好時(shí)段。因?yàn)榇笫笏晒w摘除后約2周創(chuàng)口才完全愈合,手術(shù)作為一種創(chuàng)傷會(huì)引進(jìn)大鼠應(yīng)激反應(yīng),激活HPA軸,導(dǎo)致室旁核內(nèi)大量釋放CRH,從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。綜上所述,松果體摘除導(dǎo)致大鼠