通過對家貓“SILVER”毛色基因位點(diǎn)的測定確定銀色性狀基因在哺乳動物體內(nèi)的特定位置

通過對家貓“SILVER”毛色基因位點(diǎn)的測定確定銀色性狀基因在哺乳動物體內(nèi)的特定位置摘要：通過測定家貓的SILVER基因位點(diǎn)，找到了哺乳動物中與銀色性狀或色素減退有關(guān)的一個從未報(bào)道過的新的基因組位置。存在一個沒有證實(shí)的、與銀色性狀最可能基因SILV的連鎖，于是用2個銀色毛色性狀隔離的家系進(jìn)行基因掃描。遺傳連鎖圖譜確定了D2染色體上一個3.3-Mb（95.87-99.21Mb）的SILVER基因組區(qū)域（LOD最大值=10.5,0=0），它與人類10號染色體上118.58-121.85Mb之間的基因區(qū)域顯示出保守同線性。在家貓中。SILVER位點(diǎn)的突變能抑制毛發(fā)色素的生成，但是相比于其他哺乳動物銀色變種，其對褐黑素生成的影響比真黑素更為顯著。一個新的基因位點(diǎn)SILVER的測定，為確定一個或許有助于闡明尚未弄清的褐黑素生成途徑的遺傳因子提供了更好的前景，也表明貓基因組計(jì)劃在提高我們對哺乳動物基本生物歷程中一般相關(guān)性的了解上有著很好的前景。關(guān)鍵詞：毛色，家貓，遺傳連鎖圖譜，褐黑素生成，SILVER據(jù)估計(jì)，約10000年前（Vigne等，2004）貓?jiān)谥袞|（Driscoll等，2007）被馴化，這可能是由于當(dāng)時形成了原始村莊并且儲存了糧食，結(jié)果吸引了大量的嚙齒動物。與野生型野灰色體表底色相比（圖1），家貓的祖先Felissilvestrislybica（非洲野貓），在如今已經(jīng)很難與帶有條紋的普通家養(yǎng)虎斑貓區(qū)分開來了。自貓被馴化以來，就開始出現(xiàn)廣泛的毛色和花紋變異，包括各種各樣的毛色、獨(dú)特的毛發(fā)表型，以及體表圖案（條紋、點(diǎn)和斑，包括沒有體表圖案的“tickedtabby”）。皮毛多樣性的進(jìn)程可以在大多數(shù)經(jīng)歷馴化的哺乳動物中觀察到，部分原因是家貓不再受自然種群的純化選擇，同時也是由于人類為了得到其所喜歡的顏色和圖案而進(jìn)行有目的的人工選擇（Zeuner1963；Trut1999）。圖1：野生貓（右）Felissilvestrisly和iCa于家系2生殖的銀色雄性歐西貓隨著家貓的基因組資源的開發(fā)，如綜合遺傳和輻射雜交圖（Menotti-Raymond等，1999，2003，2009；Murphy等，2000，2007；Davis等，2009；Schmidt-Kuntzel等，2009）、1.9x全基因組序列草圖（Pontius等,2007）和互動網(wǎng)絡(luò)瀏覽器（Pontius和O'Brien2007），一些能引起表型變異的基因可以在分子遺傳水平上測定或描述，如黑色基因（Eizirik等，2003）、棕色基因和肉桂色基因（SchmidtKuntzel等，2005）、淡色基因（Ishida等，2006）、暹羅和緬甸表型，白化基因（Lyons等，2005；Imes等，2006）、長發(fā)基因（Drogemuller等，2007；Kehler等,2007）和橙色基因（Schmidt-Kuntzel等，2009）。貓顯示了還沒有被繪制或描述的其他顏色變種，包括一個銀色毛發(fā)變種（圖1），這是由于被稱為“抑制”位點(diǎn)上的常染色體顯性遺傳（Vella等，1999）。在家貓中，抑制位點(diǎn)或SILVER位點(diǎn)上的突變可以抑制毛發(fā)中色素的產(chǎn)生，但相比于其他哺乳動物銀色變種，其對褐黑素生成的影響比真黑素更為顯著（Vella等，1999）。由于真黑素向褐黑素生成的轉(zhuǎn)變（Eizirik等,2003），可以在野生型貓身上看到特征性的“黃橙色”深淺條紋帶，而這些在銀色貓中幾乎是白色或無色的。此外，銀色家貓的毛發(fā)顯示銀色（接近無色）的底色，在其頭發(fā)末端（圖2）伴有可視的正常色素沉著（包括取決于其他基因位點(diǎn)的真黑素）。銀色貓中顯著的表型是“煙霧色”，這源于銀色基因?qū)Ψ且盎疑◣Ш谏?，即黑色）底色的影響。與銀色貓的毛發(fā)相比（Vella等，1999），這些貓的披毛顯示出銀白的底色，并帶有伸長的黑色末端（圖2）。SILVER并不能阻斷褐黑素的合成，橙色，銀色的虎斑貓可以證明這一點(diǎn)。然而，橙色色素沉著的顏色與橙色，非銀色貓中觀察到的顏色略有不同，其沒有可在典型橙色貓中看到的暖色的棕色色調(diào)（PfluegerS,個人通訊）。圖2：展示毛發(fā)，來自于家貓銀色（A）、煙霧色（B）、帶黑色（C）個體Dunn和Thigpen（1930）首次在小鼠中描述了SILVER基因位點(diǎn)。此后，產(chǎn)生銀色性狀的基因位點(diǎn)或色素減退表型開始在許多生物體中報(bào)道，其中包括馬，狗，牛，小鼠，鳥，雞和斑馬魚（Martinez-Esparza等，1999；Kerje等，2004；Schonthaler等，2005；Brunberg等，2006；Clark等，2006；Kuhn和Weikard，2007,Reissmann等，2007）。涉及這些“銀色”表型的基因是SILV位點(diǎn)（也稱為“銀色同源物”或PMEL17），其在黑色素小體形成的早期階段能產(chǎn)生一種重要的蛋白質(zhì)產(chǎn)物（Kobayashi等，1994；Zhou等，1994；Berson等，2001）。其遺傳模式是典型的常染色體顯性。在斑馬魚和狗中，視覺缺陷和色素減退與SILV位點(diǎn)上的突變相關(guān)（Schonthaler等，2005；Clark，2006）。攜帶merle突變的狗，其特征是SILV中插入一個短散在元件，表現(xiàn)出與正常色斑并排的淡色斑塊，并且還有聽覺異常（Clark等，2006）。在人類中，沒有報(bào)道與位于12q13-q14上SILV基因的相關(guān)突變，貓中也沒有報(bào)道與銀色表型有關(guān)的病理現(xiàn)象。哺乳動物中已有其他基因參與色素減退的報(bào)道（Mariat等，2003；Cook等，2008）。我們在這里報(bào)道家貓SILVER位點(diǎn)的測定，以此鑒定哺乳動物中銀色/色素沉著基因的一個新位點(diǎn)。材料與方法實(shí)驗(yàn)動物使用了兩個家系（圖3）。家系一是由國立衛(wèi)生研究院動物中心（NIHAC）開發(fā)的。該系由純種銀色雄性埃及貓（EgyptianMau）與三只無關(guān)聯(lián)的非銀色雜種（他們不屬于一個品種）雌貓雜交所形成。它們產(chǎn)下了7個后代，其中5個顯示銀色，表明父本是SILVER雜合子。這5名雜交1代個體（4雌1雄）與非銀色的雜種貓回交，產(chǎn)下23只第三代貓，其中19只明確地表現(xiàn)出SILVER位點(diǎn)的表型?？傮w而言，雜交1代和回交個體呈現(xiàn)出的銀色（n=14）與非銀色伍=12）表型近似1：1。另一個分離出銀色基因的家系（以下稱為“家系二”）是由一個合作的貓種養(yǎng)殖者提供的。將一只純種的銀色雄性歐西貓（Ocicat）與兩只雌貓交配，產(chǎn)下12只后代，其中5只為銀色，7只為非銀色。圖3：用于測定家貓SILVER位點(diǎn)的家系；家系1（左）；家系2（右）巴SILVER雜合雄性；^SILVER雜合雌性DNA提取采集家系一所有個體的血液樣本，作為一個標(biāo)準(zhǔn)DNA來源；此外，根據(jù)NIHAC動物實(shí)驗(yàn)協(xié)議從每只動物收集皮膚活組織檢查，并建立細(xì)胞系作為高質(zhì)量基因組材料的來源。家系二中個體提供口腔黏膜拭子樣本。按照制造商提供的方法，使用血液DNA中提或小提試劑盒（凱杰公司生產(chǎn)）分別從血液和口腔黏膜樣品中提取全血和成纖維細(xì)胞系中的DNA。用HoeferDNA定量200熒光分光光度計(jì)定量DNA（AmershamBiosciences）。每個樣品的比例用無菌蒸餾水稀釋到2.5ng/卩L的標(biāo)準(zhǔn)濃度（QualityBiological）。微衛(wèi)星的聚和酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增與基因分型利用沿著貓基因組的特定區(qū)間所選擇的微衛(wèi)星進(jìn)行基因組掃描（Murphy等,2007；Menotti-Raymond等，2009）。使用如以前所述的touchdownPCR程序（Menotti-Raymond等，2005。進(jìn)行微衛(wèi)星的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR。擴(kuò)增。樣品的電泳和基因分型，以及孟德爾遺傳檢驗(yàn)，如以前所述進(jìn)行（Ishida等，2006）。精細(xì)定位SILVER的附加微衛(wèi)星的研制在使用先前發(fā)表的貓微衛(wèi)星建立SILVER與一個基因組區(qū)域的連鎖后，從貓1.9x全基因組序列中（Pontius等人，2007）選取來自可能片段區(qū)間的附加標(biāo)記。根據(jù)其在貓D2染色體上的位置選擇微衛(wèi)星標(biāo)記，并從加菲貓（GARFIELD）基因組瀏覽器（http：//lgd.abcc.ncifcrf.vvv/cgi-bin/gbrowse/cat/）中選取標(biāo)記（Pontius和O'Brien2007）。這些包含SILVER位點(diǎn)在表1中用前綴“D2”表示。新基因位點(diǎn)的引物（補(bǔ)充材料，見附錄1）是用Primer3（http：//frodo.wi./cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）設(shè)計(jì)的（Rozen和Skaletsky，2000），包括一個用熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物M13尾巴（Boutin-Ganache等，2001）。遺傳連鎖圖譜按照Superlink的方法（Fishelson和Geiger， 2002，2004）計(jì)算出單個標(biāo)記的連鎖系數(shù)（LOD）,結(jié)果正如Ishida等（2006）和Kehler等（2007年）所描述的那樣。由于兩個家系分別由單個雄性所建立（一只是純種的埃及貓，另一只是純種的歐西貓），我們把數(shù)據(jù)既作為一個單一的家系又作為2個獨(dú)立的家系來分析。兩個家系中的相同基因組區(qū)域都繪制出SILVER位點(diǎn)（數(shù)據(jù)未顯示）。結(jié)果與分析我們通過對與SILVER最可能位點(diǎn)緊密相連的微衛(wèi)星標(biāo)記（FCA867，在B4染色體102.1Mb上）的基因分型開始我們的分析，該位點(diǎn)是貓B4染色體上96.37-96.39Mb的SILV基因（Murphy等,2007）FCA867和SILVER（LOD=-5.7,0=0）之間的連鎖關(guān)系缺乏論證,LOD值低于常規(guī)使用的值為-2的排除標(biāo)準(zhǔn)（Ott,1991），該連鎖可導(dǎo)致在貓基因組的特定區(qū)間所選擇的微衛(wèi)星啟動基因組掃描（Murphy等，2007；Menotti-Raymond等，2009）。先在2個家系中對96個微衛(wèi)星進(jìn)行基因分型，再在貓D2染色體用微衛(wèi)星FCA955（LOD=2.79,0=0.2）檢測是否有連鎖關(guān)系。在FCA955附近使用7個以前發(fā)表的微衛(wèi)星標(biāo)記和從貓基因組互動瀏覽器GARFIELD（http：///cgi-bin/gbrowse/cat）中選擇的另外11個微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)的遺傳圖繪制（Pontius和O'Brien2,007）（補(bǔ)充材料，見附錄1）。將SILVER可能區(qū)域確定在一個3.3-Mb區(qū)域，該區(qū)域在D2染色體上FCA1240標(biāo)記（95.87Mb）和D2_99.21標(biāo)記（99.21Mb）之間（LOD

最大值=10.5,0=0（表1）,它與人類10號染色體上118.58-121.85Mb之間的基因區(qū)域顯示出保守同線性。根據(jù)人類基因組（版本36）（/projects/mapview/stats/BuildStats.cgi？taxid59606&build536&ver53）,該區(qū)域包括大約17個基因組（補(bǔ)充材料，附錄2）這些基因不同于之前所知的其他物種的銀色毛發(fā)、淡色毛發(fā)或色素沉著基因。表1用于測定SILVER的微衛(wèi)星標(biāo)記MarkeraLODQCatChrD2DogChr28bHumanChr10cFCA9552.80.286,022,42621,788,479108,516,870FCA12392.00.186,789,15722,486,644109,388,134FCA12413.70.291,583,98526,143,901113,744,643D2_593,358,57928,191,399116,105,982D2_93,900,28428,668,678116,660,785D2_94,524,84429,257,166117,375,668D2_595,192,20029,813,138117,921,715FCA9545.80.0595,823,88830,338,383118,536,757FCA12407.40.0595,875,32530,384,390118,588,972D2_96.110.5096,114,95630,595,675118,846,522D2_96.98.1096,990,09931,332,116119,656,273D2_98.110.2098,100,27432,256,893120,742,485D2_98.67.8098,601,08332,659,233121,227,619D2_99.165.3099,167,85133,131,599121,797,461D2_599,219,02533,175,512121,850,894D2_99.276.70.0599,275,74733,215,309121,887,548F415.10.199,706,53433,563,419122,318,976FCA12421.90.1105,677,50138,419,330127,982,490FCA12430.60.3107,394,18339,793,387129,659,013a粗體的標(biāo)記是之前已發(fā)表的，其他標(biāo)記是從GARFIELD基因組瀏覽器中選取的，如材料與方法所述b由Blat基因檢索的400bp貓基因組DNA，位于2005年5月組成的狗染色體兩端，使用UCSC基因組瀏覽器預(yù)估而來。c2006年3月組成的人類染色體位點(diǎn)，使用UCSC基因組瀏覽器將狗染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)換而來。在貓SILVER基因中一個有吸引力的可能基因是SLC18A2，它是溶質(zhì)載體家族18的成員。SLC18A2在人和嚙齒動物模型中被描述為囊狀單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)一元胺累積成囊泡（Peter等，1995）。相關(guān)基因（SLC45A和SLC36A1）的突變可導(dǎo)致馬奶油色和香檳色毛色的色素沉著（Mariat等，2003；Cook等，2008）、小鼠白血?。╱w）表型色素沉著減少（Lehman等，2000）、和歐洲人蒼