五靈膠囊抗慢性肝損傷的實驗研究

五靈膠囊抗慢性肝損傷的實驗研究

五靈膠囊是一種中藥復(fù)方制劑。它對慢性肝炎的治療有效，療效好得多。為了探討五靈膠囊治療慢性肝炎的作用機(jī)制,為臨床用藥提供藥理學(xué)依據(jù)。本實驗采用在體、離體肝損傷模型,研究五靈膠囊對肝損傷及對肝細(xì)胞的修復(fù)和保護(hù)作用。1材料和方法1.1藥物、試劑與儀器動物:昆明小鼠,♂,體重(18±2)g;SD大鼠,♂,體重(250±10)g,[由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供,動物合格證號:醫(yī)動證字SC×K(軍)2002-05]。試劑:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH-L)、膽堿酯酶(CHE);試劑盒:(購于北京中生北控生物科技股份有限公司);單胺氧化酶(MAO)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)試劑盒(購于南京建成生物工程研究所);四氯化碳(CCl4):(AR,批號20001018);DMEM/F12培養(yǎng)基:(USA.Gibco公司產(chǎn)品,批號1095578);胎牛血清(FBS):(杭州四季青,批號0206112,用前56℃滅活,30min)。藥物:五靈膠囊(西京醫(yī)院制劑室,批號20020207)。五靈丸(博愛制藥有限公司,批號20020312),D-氨基半乳糖(D-GlaN)(重慶醫(yī)科大學(xué),批號97-7-28),脂多糖(LPS),(USA.Sigma公司,批號69H4046);儀器:BB16/賀利氏氣體培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司),MD-100全自動生化儀(USA.CCA)。1.2對五靈膠囊的考察昆明小鼠60只,♂,體重(18±2)g,隨機(jī)分成6組,即正常組、模型組、五靈膠囊3個劑量組和五靈丸組,每組10只。正常組ip生理氯化鈉溶液10ml·kg-1,其余各組均ipD-氨基半乳糖0.3g·kg-1,隔2d注射1次。造模10d后開始給藥。正常組與模型組ig生理氯化鈉溶液10ml·kg-1,陽性對照組ig五靈丸9g·kg-1(相當(dāng)于生藥10.08g·kg-1),五靈膠囊3個劑量組分別ig五靈膠囊4g·kg-1(相當(dāng)于生藥14.96g·kg-1)、2g·kg-1(相當(dāng)于生藥7.48g·kg-1)、1g·kg-1(相當(dāng)于生藥3.74g·kg-1)。各組給藥期間仍ipD-氨基半乳糖,隔2d注射1次(正常組ip生理氯化鈉溶液)連續(xù)給藥11d后,禁食自由飲水,次日給藥2h后,小鼠眼眶取血,3000r/min,離心15min,取血清測定ALT、CHE;另取肝臟0.5g,加TMS緩沖液制成10%肝勻漿(4℃)10000r/min,離心20min,取上清液測定ALT、CHE。昆明小鼠60只,♂,體重(18±2)g,分組同上,正常組sc生理氯化鈉溶液2ml·kg-1,其余各組均sc20%CCl4-香油溶液2ml·kg-1,隔3d注射1次。造模9d后開始給藥。正常組與模型組ig生理氯化鈉溶液10ml·kg-1,陽性對照組ig五靈丸9g·kg-1(相當(dāng)于生藥10.08g·kg-1),五靈膠囊3劑量組分別ig五靈膠囊4、2、1g·kg-1。各組給藥期間仍sc20%CCl4-香油溶液,隔3d注射1次(正常組sc生理氯化鈉溶液)。連續(xù)給藥10d后,禁食自由飲水,次日給藥2h后,小鼠眼眶取血,3000r/min,離心15min,取血清測定ALT、CHE。另取肝臟0.5g,加TMS緩沖液制成10%肝勻漿,4℃、10000r/min,離心20min,取上清液測定ALT、CHE。1.3肝組織病理學(xué)檢查取經(jīng)福爾馬林中性緩沖液固定的肝組織標(biāo)本,石蠟包埋。切片厚5μm,作HE染色,光鏡下檢查。1.4實驗分組及藥物作用試驗取12周齡大鼠,♂,ip25%烏拉坦2ml麻醉,按文獻(xiàn)操作制備原代肝細(xì)胞,肝細(xì)胞重懸于20%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液中,調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個細(xì)胞·ml-1,接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi),置37℃,5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h后,吸棄培養(yǎng)液,分組:空白對照組:每孔加10%FBS-DMEM/F12;D-GlaN、LPS損傷組加含0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS的l0%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液;五靈膠囊3組:五靈膠囊4、3、2mg·ml-1的l0%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液(以藥粉計)。(1)肝細(xì)胞的修復(fù)作用試驗:肝細(xì)胞置24孔板內(nèi)培養(yǎng)48h,空白對照組每孔加10%FBS-DMEM/F12、余下各試驗組分別加入含有0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS的l0%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液各1ml/孔,培養(yǎng)24h,終止培養(yǎng),吸棄上清液,全部試驗組經(jīng)無血清DMEN培養(yǎng)液漂洗1次。空白對照組加10%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液,損傷組各加0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS的l0%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液,各試驗藥物組分別加試驗藥物培養(yǎng)液1ml/孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h,取培養(yǎng)上清測定ALT、MAO、LDH-L、GSH-ST、MDA。(2)肝細(xì)胞的保護(hù)作用試驗:上述各組加入各試驗藥物1ml/孔,37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h,終止培養(yǎng),吸棄上清液,全部試驗組經(jīng)無血清DMEM培養(yǎng)液漂洗1次?？瞻讓φ战M加10%FBS-DMEM/F12、損傷組加含有0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS的l0%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液1ml/孔,余下各組加含有0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS的l0%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液1ml/孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h,取上清液測定ALT、MAO、LDH-L、GSH-ST、MDA。2結(jié)果2.1對肝勻漿alt的影響肝勻漿ALTCHE的影響模型組與正常組比較血清ALT明顯升高(P<0.01)。模型組小鼠血清CHE明顯降低于正常組(P<0.01)。五靈膠囊組血清中ALT顯著下降(P<0.01)。五靈膠囊組降低ALT的作用強(qiáng)于五靈丸。五靈膠囊大劑量、中劑量組能顯著升高血清CHE,與模型組比較差異顯著,且有明顯劑量依賴關(guān)系。其中,大劑量組升高CHE作用強(qiáng)于五靈丸組(P<0.01),五靈膠囊小劑量組無效(P>0.05)。模型組肝勻漿ALT明顯低于正常組(P<0.01)。五靈膠囊大劑量對肝勻漿ALT無明顯升高作用;中、小劑量及五靈丸可使肝勻漿中ALT顯著升高(P<0.05)。見表1。2.2對小鼠血清中alt和che的影響肝勻漿ALTCHE的影響模型組小鼠血清和肝勻漿ALT明顯升高,高于正常組(P<0.01)。五靈膠囊3組和五靈丸組小鼠血清中ALT低于模型組(P<0.01);五靈膠囊3組降A(chǔ)LT作用強(qiáng)于五靈丸且無劑量依賴性。模型組小鼠血清和肝勻漿CHE明顯低于正常組(P<0.01)。五靈膠囊大劑量組降肝勻漿ALT無明顯作用,中、小劑量降肝勻漿ALT作用顯著,五靈膠囊3組和五靈丸組小鼠血清和肝勻漿CHE均明顯升高,與模型組差異顯著(P<0.01),見表2。2.3肝治療肝病理組織病理結(jié)果正常組見圖1(A):肝細(xì)胞呈放射狀排列,胞漿豐富,嗜酸性染色,核圓形,核仁清晰。竇內(nèi)皮細(xì)胞分布規(guī)則,可見枯否氏細(xì)胞。匯管區(qū)伴有少量的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞。模型組(D-GlaN損傷)見圖1(B):肝細(xì)胞腫脹或縮小,肝竇排列紊亂,擠壓變窄。有部分肝小葉壞死,呈點狀與灶狀,肝細(xì)胞內(nèi)有脂褐素和污綠色的膽色素沉積。肝小葉周邊肝細(xì)胞氣球樣變周圍有少量的淋巴細(xì)胞浸潤。竇腔與肝細(xì)胞索間成纖維細(xì)胞增多,內(nèi)皮細(xì)胞激活,枯否氏細(xì)胞肥大。五靈膠囊組見圖1(C):光鏡下觀察,部分肝細(xì)胞濁腫,肝小葉排列較齊,未見明顯的竇腔狹窄。中央靜脈周圍少數(shù)細(xì)胞胞漿疏松,呈顆?；蚪z狀,核染色略淡。肝細(xì)胞的再生明顯,新生肝細(xì)胞的細(xì)胞核體積增大,染色質(zhì)增多而著色深,核仁明顯,雙核居多。未見碎性肝小葉性壞死,匯管區(qū)內(nèi)也未見炎細(xì)胞浸潤。模型組(CCl4損傷)見圖2(A):肝細(xì)胞氣球樣變,核固縮或潰破,肝索排列紊亂,中央靜脈周圍有大量壞死的肝細(xì)胞,并伴有中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤?？莘袷霞?xì)胞增生肥大,竇內(nèi)皮細(xì)胞激活,成纖維細(xì)胞增多,膠原大量增生,形成假小葉。五靈膠囊組見圖2(B):肝小葉結(jié)構(gòu)大致正常,肝細(xì)胞變性程度減輕,在中央靜脈與大的匯管區(qū)有少量膠原纖維,但無纖維隔形成。五靈丸組:肝細(xì)胞濁腫多于五靈膠囊組,竇腔狹窄,可見嗜酸性小體。肝細(xì)胞致密,染成粉紅色,核仁淡染或消失,呈蠟染者居多,有的肝細(xì)胞呈輕微的氣球樣變,累及5-8個細(xì)胞區(qū)域。2.4不同劑量對alt、mao、ldh-l、gsh-st、mda水平的影響大鼠原代肝細(xì)胞在含0.5mmol·L-1D-GlaN培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h,培養(yǎng)上清中ALT、MAO、LDH-L、GSH-ST、MDA,均顯著高于對照組數(shù)倍(P<0.01),肝細(xì)胞嚴(yán)重受損,受損的肝細(xì)胞加入不同劑量藥液培養(yǎng)24h,其培養(yǎng)上清中ALT、MAO、LDH-L、GSH-ST、MDA水平顯著降低,與D-GlaN比較,有顯著性差異(P<0.05～0.01)且降A(chǔ)LT,MAO呈明顯的劑量依賴關(guān)系。大鼠原代肝細(xì)胞與LPS培養(yǎng),上清中酶譜結(jié)果與D-GlaN相似,反映肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷,五靈膠囊能使受損肝細(xì)胞升高的酶譜水平下降,顯著低于LPS組(P<0.05～0.01),五靈膠囊2mg·ml-1組無降LDH-L、GSH-ST作用,見表3、4。2.5靈膠囊對小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用不同劑量的五靈膠囊與肝細(xì)胞培養(yǎng)24h后,棄除培養(yǎng)上清,分別加入0.5mmol·L-1D-GlaN、20μg·L-1LPS再培養(yǎng)24h,五靈膠囊大、中劑量對2種毒劑均有保護(hù)作用,2mg作用不明顯。且有一定量效關(guān)系,能有效的對抗2種毒劑導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷。見表5、6。3靈膠囊對d-glan的誘導(dǎo)體內(nèi)實驗表明五靈膠囊對CCl4肝損傷可顯著地降低血清與肝組織ALT,升高由肝損傷時降貯存功能酶CHE,有效地對抗CCl4在體內(nèi)產(chǎn)生三氯甲基所導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化使肝細(xì)胞壞死,肝功能衰竭,組織學(xué)證實:五靈膠囊可使CCl4慢損傷小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)大致正常,其治療小鼠肝細(xì)胞變性減輕及壞死面積的改變與炎細(xì)胞浸潤等病理特征與CCl4損傷組有顯著差異。顯示有明顯修復(fù)作用。D-GlaN作用于肝臟后,可導(dǎo)致肝質(zhì)膜受損,鞘磷脂含量及5-核苷酸酶活性降低,膜蛋白合成減少,造成肝細(xì)變性壞死。五靈膠囊可使D-GlaN導(dǎo)致的小鼠血清與肝組織內(nèi)升高ALT明顯地降低,CHE活性顯著升高,組織學(xué)也證實對D-GlaN誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞變性減輕,壞死面積的改變、炎細(xì)胞浸潤等病理特征,呈現(xiàn)良好修復(fù)和保護(hù)作用。原代培養(yǎng)正常肝細(xì)胞受D-GlaN作用后,胞膜通透性增高,各種酶逸出進(jìn)入培養(yǎng)上清。五靈膠囊可使損傷原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清ALT、MAO、LDH-L、GSH-ST、MDA水平顯著降低,修復(fù)受損的肝細(xì)胞有量效關(guān)系。結(jié)果提示五靈膠囊治療慢性肝損傷與保護(hù)肝質(zhì)膜、增加肝細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)蛋白合成,有效地防止膜的脂質(zhì)氧化作用有關(guān)。LPS激活單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系統(tǒng),釋放多種細(xì)胞因子如TNF-а、IL-1、IL-6、NO介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷,五靈膠囊對LPS誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞損傷有很好的修復(fù)作用,使LPS導(dǎo)致上升的ALT、MAO、LDH-L、G