基因工程重點(diǎn)

基因工程基因：是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是DNA分子上含有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱(chēng)，是含有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段?；驁D譜：基因組：指單倍染色體細(xì)胞中涉及編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子。載體：能載帶微量物質(zhì)共同參加某種化學(xué)或物理過(guò)程的常量物質(zhì)，是基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞中的一種能自我復(fù)制的DNA分子，三種常見(jiàn)的載體為細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒?？寺≥d體：事實(shí)上是一種含有特定功效的DNA分子，它們能攜帶外源DNA片段或基因進(jìn)入細(xì)胞，并使其在受體細(xì)胞中得以維持體現(xiàn)。體現(xiàn)載體：體現(xiàn)載體是用來(lái)在受體細(xì)胞中體現(xiàn)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）外源基因的載體。穿梭載體：YRp型載體是酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的其中酵母DNA片段不僅提供了選擇標(biāo)記還攜帶來(lái)自酵母染色體DNA的自主復(fù)制次序(ARS).由于它同時(shí)含有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制基因，因此能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制.能夠在兩種截然不同的生物細(xì)胞中復(fù)制的載體稱(chēng)為穿梭載體。（這類(lèi)載體能夠在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和體現(xiàn)。）RACE技術(shù)：RACE是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段cDNA片段，通過(guò)往兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3'端和5'端的辦法。密碼子：mRNA上有一段編碼區(qū)，在這一區(qū)段內(nèi)，每3個(gè)核苷酸構(gòu)成一種密碼子，密碼多肽鏈上的一種氨基酸。CDNA文庫(kù)：某種生物材料的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成不同的cDNA片段，與克隆載體重組后貯存在受體菌群體中，這樣的群體稱(chēng)為cDNA基因文庫(kù)。SD序列：mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。SD序列在細(xì)菌mRNA起始密碼子AUG上游10個(gè)堿基左右處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與細(xì)菌16SrRNA3’端識(shí)別，協(xié)助從起始AUG處開(kāi)始翻譯。MCS：多克隆位點(diǎn)，是包含在多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的一段很短的DNA序列，是基因工程中慣用到的載體質(zhì)粒的原則配備序列。EST：體現(xiàn)序列標(biāo)簽，是指基因序列中一段能特異地標(biāo)記或表征基因的序列。（普通它含有足夠的構(gòu)造信息以顯示出該基因與其它基因的差別，長(zhǎng)度為100~500bp。）探針：是指含有同特異性目的分子產(chǎn)生很強(qiáng)的互相作用并可對(duì)其互相作用的產(chǎn)物進(jìn)行有效檢測(cè)的分子。藍(lán)白斑篩選：是一種基因工程慣用的細(xì)菌重組子的篩選辦法，重組菌斑呈無(wú)色透明，非重組菌斑則呈藍(lán)色。轉(zhuǎn)座子：它是一種特殊的DNA序列，能夠在染色體上從一種位置跳躍到另一種位置，或者在染色體之間跳躍。增強(qiáng)子：是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列，可處在上游，也可處在下游。啟動(dòng)子：是一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，它普通位于基因的上游。操縱子：是一組核心的核苷酸序列，涉及了一種操縱基因（Operator），一種普通的啟動(dòng)子，及一種或以上的構(gòu)造基因被用作生產(chǎn)信使RNA（mRNA）的基元?；蛟\療：就是在基因水平上對(duì)疾病或人體的狀態(tài)進(jìn)行診療，它涉及產(chǎn)前診療，是一種新的臨床診療辦法?；蛑委煟菏侵敢哉５幕蛱娲蛐扪a(bǔ)患者細(xì)胞中的缺點(diǎn)基因從而達(dá)成治療疾病的目的，是治療分子疾病最有效的手段之一。基因敲除：基因敲除又稱(chēng)基因打靶，該技術(shù)通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，含有專(zhuān)一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。它是在胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)基礎(chǔ)，上發(fā)展起來(lái)的。轉(zhuǎn)染：是采用與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞相似的辦法，將重組λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過(guò)程。轉(zhuǎn)化：外源遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA等)進(jìn)入細(xì)菌，引發(fā)細(xì)菌遺傳變化的現(xiàn)象。粘性末端：兩條DNA鏈上磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置是交錯(cuò)的，酶切成果使DNA片段末端的一條鏈多出1至幾個(gè)核苷酸，可同另一DNA片段互補(bǔ)核苷酸末端黏結(jié)，這樣的DNA片段稱(chēng)為黏性末端。平末端：兩條DNA鏈上磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置處在識(shí)別序列的對(duì)稱(chēng)構(gòu)造中心，酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端是平齊的，稱(chēng)之為平末端。DNA芯片：又稱(chēng)基因芯片，它是指用原位合成或顯微印刷技術(shù)，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锏谋砻嫔?，產(chǎn)生的二維DNA探針陣列?；蝮w現(xiàn)：是指生物基因組中構(gòu)造基因所攜帶的遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過(guò)程，合成特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功效和生物學(xué)效應(yīng)的全過(guò)程。簡(jiǎn)答題和敘述題1.克隆載體DNA的基本條件。（1）針對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性（2）自主復(fù)制功效（3）明顯的篩選標(biāo)記（4）特定的多克隆位點(diǎn)（5）安全性2.限制性?xún)?nèi)切酶的活性受什么因素的影響。⑴酶的純度。⑵DNA樣品的純度。⑶DNA的甲基化程度。⑷酶切反映的溫度與時(shí)間。⑸DNA分子的構(gòu)型。⑹限制性核酸內(nèi)切酶的反映緩沖液。3.質(zhì)粒的相溶性及機(jī)制。能在同一宿主細(xì)胞中共存的不同質(zhì)粒稱(chēng)為親和性質(zhì)?；蛳嗳苄?。質(zhì)粒復(fù)制必須同細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，多個(gè)質(zhì)粒有各自的結(jié)合位點(diǎn)，而親緣關(guān)系親密的質(zhì)粒有著相似的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)一種質(zhì)粒占滿結(jié)合位點(diǎn)后，親緣關(guān)系親密的其它質(zhì)粒即使進(jìn)入細(xì)胞也無(wú)立足之地，只能自行消失。4.染色體步移的環(huán)節(jié)。（1）首先用已知的基因或分子標(biāo)記作為探針，從基因文庫(kù)中篩選出與其有共同序列的克隆。（2）再以克隆DNA片段制備探針從文庫(kù)中篩選出與之有部分重疊且更加靠近目的基因的一種新克隆。同理，以新克隆DNA片段作探針能夠依次篩選出某些列克隆來(lái)，直至獲得所需的目的基因克隆。5.提高外源基因體現(xiàn)的辦法。（1）構(gòu)建融合蛋白體現(xiàn)系統(tǒng)（2）構(gòu)建分泌蛋白體現(xiàn)系統(tǒng)（3）構(gòu)建包涵體體現(xiàn)系統(tǒng)（4）選擇蛋白水解酶基因缺點(diǎn)型的受體系統(tǒng)6.原核細(xì)胞是抱負(fù)受體細(xì)胞的因素。（1）大部分原核生物細(xì)胞沒(méi)有纖維素構(gòu)成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，便于外源DNA的進(jìn)入。（2）沒(méi)有核膜，染色體DNA沒(méi)有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩。（3）基因組簡(jiǎn)樸，不含線粒體和質(zhì)體基因組，便于對(duì)引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析。（4）原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物，容易獲得一致性的實(shí)驗(yàn)材料，并且培養(yǎng)簡(jiǎn)樸，繁殖快速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快。7.細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和小牛堿性磷酸酶（CIP）的差別與應(yīng)用。差別：CIP更為慣用，因其在60℃～70℃條件下保溫15min就能夠完全失活，便于終止反映;而B(niǎo)AP是耐熱性酶，必須用酚-氯仿重復(fù)提取才干除去，終止反映。且CIP的活性高出BAP10～20倍。應(yīng)用：（1）一是脫載體末端的磷酸基，避免在DNA重組時(shí)載體分子的自我連接。（2）另一用途就是和T4多聚核苷酸激酶合用，用于DNA的末端標(biāo)記。8.DNA芯片的應(yīng)用。（1）基因測(cè)序（2）基因體現(xiàn)水平的檢測(cè)（3）基因診療（4）新藥篩選（5）臨床用藥9.腫瘤的細(xì)胞因子治療有哪些種類(lèi)。（1）免疫效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子基因治療。（2）腫瘤細(xì)胞靶向的細(xì)胞因子基因治療。（3）成纖維細(xì)胞等載體細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子基因治療。（4）以抗原呈遞細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞因子基因治療。（5）腫瘤細(xì)胞靶向的細(xì)胞因子受體基因治療。10.構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的方略。（1）能在受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制，并有較多的拷貝數(shù)。（2）含有外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，并且克隆位點(diǎn)越多越好。（3）含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。（4）載體DNA分子應(yīng)盡量的小。（5）構(gòu)建不同用途的質(zhì)粒載體時(shí)，能夠根據(jù)特殊需要組裝多個(gè)元件。11.增強(qiáng)子的特性。（1）雙向性（2）重復(fù)序列（3）增強(qiáng)子行使功效與所處的位置無(wú)關(guān)（4）特異性（5）增強(qiáng)子不僅與同源基因相連時(shí)有調(diào)控功效，與異源基因相連時(shí)也有功效。12.代謝工程中提高目的產(chǎn)物的辦法。（1）增加限速環(huán)節(jié)酶編碼基因的拷貝數(shù)（2）強(qiáng)化以啟動(dòng)子為主的核心基因的體現(xiàn)系統(tǒng)（3）提高途徑激活因子的合成速率（4）滅活途徑克制因子的編碼基因填空或者選擇轉(zhuǎn)基因的環(huán)節(jié)及檢測(cè)辦法。松弛型質(zhì)粒與嚴(yán)緊型質(zhì)粒的區(qū)別。松弛型質(zhì)粒：拷貝數(shù)較多（10拷貝數(shù)以上）嚴(yán)緊型質(zhì)粒：拷貝數(shù)少（1至數(shù)個(gè)拷貝）普通而言，小質(zhì)粒多為松弛型的，大質(zhì)粒多為嚴(yán)緊型質(zhì)粒的，但無(wú)嚴(yán)格界限。那些酶需要引物，那些酶不要引物。需要引物的酶：引物酶、DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶不需要引物的酶：RNA聚合酶三種blot檢測(cè)的產(chǎn)物是什么。southern印跡雜交：DNA分子northern印跡雜交：RNA分子western印跡法：蛋白質(zhì)多個(gè)載體的容量。質(zhì)粒載體容量：不大于10kb。λ噬菌體載體容量：9～23kbDNA連接酶的活性以及使用辦法。DNA連接酶，也稱(chēng)DNA黏合酶，此酶依賴(lài)腺苷三磷酸(ATP)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)水解提供的能量，催化毗鄰的一條DNA鏈的5磷酸基(5'-P)與另一條DNA鏈的3-羥基(3'-OH)之間發(fā)生縮合反映生成磷酸二酯鍵，成果使斷裂的DNA鏈重新接合，或使雙鏈DNA上核苷酸之間因磷酸二酯鍵斷裂而造成的裂口重新閉合。DNA連接酶不能催化兩條游離的DNA單鏈的連接,也不能催化雙鏈中DNA因缺失一種或多個(gè)核苷酸所造成的缺口(gap)連接。在細(xì)胞內(nèi)，DNA連接酶參加DNA的復(fù)制、修復(fù)和重組作用;在體外，DNA連接酶參加人為控制的DNA片段連接，使基因在試管內(nèi)重構(gòu)成為可能基因的概念是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是DNA分子上含有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱(chēng)，是含有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段。限制性?xún)?nèi)切酶的活性。星號(hào)活性病毒載體的應(yīng)用。構(gòu)建cDNA基因文庫(kù)用于克隆外源目的基因總結(jié)多個(gè)酶類(lèi)活性的方向。CDNA文庫(kù)的構(gòu)建辦法。環(huán)節(jié)：（1）分離細(xì)胞總RNA，并從總RNA中分離純化出mRNA。（2）以mRNA分子為模板，合成cDNA第一鏈。（3）雙鏈cDNA的合成。辦法一：大腸桿菌RNaseH酶降解取代法辦法二：oligo寡聚引物引導(dǎo)法合成雙鏈cDNA。辦法三：PCR法辦法四：固相支持法（4）將合成的雙鏈cDNA與載體重組，導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞增殖質(zhì)粒的提取和電泳。細(xì)菌人工染色體的特性。BAC載體的容納能力普通為100~350kb,容量比YAC載體小，但也含有YAC載體無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，以下(1)BAC的復(fù)制子來(lái)源于F因子，可穩(wěn)定遺傳，缺失、嵌合及重組現(xiàn)象少。(2)以大腸桿菌為宿主,對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用小，轉(zhuǎn)化率高。(3)從大腸桿菌中提取制備及其體外操作等更方便。(4)構(gòu)建BAC文庫(kù)比YAC文庫(kù)更容易。(5)能夠通過(guò)菌落原位雜交來(lái)篩選目的基因，方便快捷。(6)BAC載體在克隆位點(diǎn)的兩側(cè)含有T7和SP6聚合酶啟動(dòng)子，能夠用于轉(zhuǎn)錄獲得RNA探針或直接用于插人片段的末端測(cè)序?；谏鲜鰞?yōu)越性，BAC載體成為大片段基因組文庫(kù)的重要載體，也是基因組測(cè)序和基因組遺傳圖譜和物理圖譜構(gòu)建的重要工具。λ噬菌體載體的特性。λ噬菌體由DNA(λDNA)和外殼蛋白構(gòu)成。λ噬菌體分頭部和尼部，DNA集中在頭部。λ噬菌體DNA在噬菌體中是線狀DNA分子，全長(zhǎng)48502bp,左右兩端備有12個(gè)核苷酸構(gòu)成的5凸出黏性末端,并且兩者的核肯酸序列互補(bǔ)，即λDNA進(jìn)人宿主細(xì)胞后，黏性末端連接后形成環(huán)狀DNA分子。把此能連接的末端稱(chēng)為cos位點(diǎn)。黏性末端和平末端。其一，兩條DNA鏈上磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置是交錯(cuò)的，酶切成果使DNA片段末端的一條鏈多出1至幾個(gè)核苷酸，可同另一DNA片段互補(bǔ)核苷酸末端黏結(jié)，這樣的DNA片段末端稱(chēng)為黏性末端。如果DNA片段未端的3'端比5'端長(zhǎng)的稱(chēng)為3'黏性末端;同樣，DNA片段5'端比3'端長(zhǎng)的稱(chēng)為5'黏性末端。其二，兩條DNA鏈上磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置處在識(shí)別序列的對(duì)稱(chēng)構(gòu)造中心，酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端是平齊的，稱(chēng)之為平末端。探針標(biāo)記的辦法。切口平移標(biāo)記法隨機(jī)引物標(biāo)記法末端標(biāo)記法mRNA的分布。（1）細(xì)胞中mRNA的含量即使只占RNA總量的1%~5%，但是mRNA的種類(lèi)繁多，一種哺乳類(lèi)動(dòng)物的細(xì)胞中就有成千上萬(wàn)種不同的mRNA分子。（2）真核細(xì)胞的一種mRNA分子普通只攜帶一種肽鏈編碼信息，合成一種多肽鏈，屬于單順?lè)醋拥男问?。?）原核生物構(gòu)造基因轉(zhuǎn)錄的mRNA普通是不通過(guò)加工的，其5’端不含“帽子”構(gòu)造;3端不含poly(A)“尾巴”?；蛑委熍c基因類(lèi)型。是指以正常的基因替代或修補(bǔ)患者細(xì)胞中的缺點(diǎn)基因從而達(dá)成治療疾病的目的，是治療分子疾病最有效的手段之一。類(lèi)型：第一：正?；?，第二：反義基因，第三，自殺基因提高真核生物基因體現(xiàn)水平的辦法。全酶與核心酶。核心酶（coreenzyme）：大腸桿菌的RNA聚合酶全酶由5個(gè)亞基構(gòu)成（α2β，βδ），沒(méi)有δ基的酶叫核心酶。酶蛋白和輔因子單獨(dú)存在時(shí)，均無(wú)催化活力。只有兩者結(jié)合成完整的分子時(shí)，才含有活力。此完整的酶分子成為全酶。全酶=酶蛋白+輔因子RNA聚合酶的活性和種類(lèi)。RNA聚合酶Ⅰ:合成核糖體RNA(rRNA)前體45S,當(dāng)成熟后會(huì)成為28S、18S及5,8S核糖為RNA,是將來(lái)核糖體的重要RNA部份。RNA聚合酶Ⅱ:合成信使RNA(mRNA)的前體及大部份小核RNA(snRNA)以及微型RNA(microRNA)。由于它在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中需要多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子才干與啟動(dòng)子結(jié)合,因此這是現(xiàn)時(shí)最多研究的種類(lèi)。RNA聚合酶Ⅲ:合成轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNAS)、rRNA5S及其它能夠在細(xì)胞胞核及原生質(zhì)找到的細(xì)小的RNA。理解基因工程產(chǎn)生的藥品的種類(lèi)?；蚬こ碳に仡?lèi)藥品基因工程細(xì)胞因子類(lèi)藥品基因工程抗體基因工程受體基因工程疫苗cos序列的概念。噬菌體λ為線性雙鏈DNA病毒,野生型的λ噬菌體其基因組兩端各有12個(gè)核苷酸的5’突出，堿基互補(bǔ)，為極有效的粘性末端，稱(chēng)為COS序列。甲基化酶的作用。甲基化酶普通與限制性?xún)?nèi)切核酸酶含有相似的識(shí)別序列，因此用限制性?xún)?nèi)切核酸酶的名稱(chēng)來(lái)命名甲基。（1）一旦在識(shí)別序列中的核苷酸被甲基化酶甲基化，就會(huì)影響限制性?xún)?nèi)切核酸酶的酶切效率。（2）甲基化對(duì)DNA起著保護(hù)作用，為了DNA的某些區(qū)域不被限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切，能夠使其中的某些識(shí)別序列的堿基用甲基化終止子的