SDHIs和QoIs殺菌劑抗性研究進(jìn)展

使用化學(xué)殺菌劑是防治農(nóng)作物病害的重要措施之一，極大地保障了農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，殺菌劑逐漸從單一的多作用位點(diǎn)殺菌劑發(fā)展為高效選擇性殺菌劑，琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs）和甲氧基丙烯酸酯類（QoIs）殺菌劑是目前市面上使用體量較大的選擇性殺菌劑，但是隨著藥劑使用時(shí)間、范圍、頻率的不斷增加，殺菌劑抗藥性問題也變得越來越普遍和嚴(yán)重，常突發(fā)性暴發(fā)導(dǎo)致防治失敗，造成農(nóng)作物減產(chǎn)、減質(zhì)，極大地增加了有害生物的防治難度。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外殺菌劑抗性進(jìn)展，詳細(xì)介紹了SDHI和QoIs2類藥劑的抗性發(fā)生現(xiàn)狀和抗性機(jī)制，并總結(jié)了抗藥性監(jiān)測(cè)手段，提出了抗藥性治理建議，旨在為我國(guó)有害生物科學(xué)防控、殺菌劑抗性治理提供理論參考。01、殺菌劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀1.1琥珀酸脫氫酶抑制劑類琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs）類殺菌劑在分子上均有（苯）酰胺結(jié)構(gòu)，故又名酰胺類殺菌劑，是殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)（FRAC）于2009年劃分出來的一類作用機(jī)制和抗性機(jī)理相似的化合物。該類殺菌劑作用機(jī)制為抑制病原菌線粒體呼吸電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶活性，干擾呼吸作用，阻礙能量產(chǎn)生，從而殺死病原菌。最早的SDHIs殺菌劑———萎銹靈于19世紀(jì)60年代上市，主要用于防治谷類作物銹病和黑粉病等擔(dān)子菌病害，因其易氧化和光解，多用于種子處理[1]。直到2003年，巴斯夫公司創(chuàng)制出第一個(gè)能夠用于噴霧和具有廣譜殺菌活性的殺菌劑———啶酰菌胺[2]，推動(dòng)了SDHIs類殺菌劑的快速發(fā)展。目前，一系列新型SDHIs，如氟吡菌酰胺、異丙噻菌胺、氟唑菌酰羥胺和聯(lián)苯吡嗪菌胺等，已被廣泛用于防治多種作物白粉病、葉斑病、菌核病、灰霉病、赤霉病等真菌病害。其中氟吡菌酰胺還可通過土壤處理防治多種作物根結(jié)線蟲病。SDHIs藥劑均含有酰胺基（-CONH-）基團(tuán)，相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)也決定了該類藥劑作用機(jī)理相似———與作用靶標(biāo)琥珀酸脫氫酶單位點(diǎn)結(jié)合，靶標(biāo)位點(diǎn)突變即可產(chǎn)生抗藥性。19世紀(jì)90年代，Leroux[3]研究報(bào)道了生產(chǎn)上首例真菌褐黑粉菌（Ustilagonuda）對(duì)萎銹靈產(chǎn)生了抗藥性。在啶酰菌胺上市4年后，Zhang等[2]報(bào)道了田間和實(shí)驗(yàn)室灰霉病菌（Botrytiscinerea）對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生了抗藥性。隨著田間用藥的增加，抗性問題也日益突出?；颐共【鷮?duì)SDHIs的抗性問題呈高發(fā)趨勢(shì)，Hu等[4]發(fā)現(xiàn)田間分離的草莓灰霉菌株對(duì)啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺和吡噻菌胺的抗性頻率在3年內(nèi)分別增加至30.0%、1.0%、5.5%和7.4%。除了灰霉病菌以外，多種田間病原菌也對(duì)該類藥劑產(chǎn)生抗性，如桃褐腐病菌[5]、黃瓜白粉病菌[6]均對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生抗性，大麥網(wǎng)班病菌對(duì)大多數(shù)SDHIs藥劑產(chǎn)生抗性[7]，以及殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)（FRAC）報(bào)道田間發(fā)現(xiàn)大豆銹病、油菜菌核、大麥葉斑抗性菌株等。除抗性發(fā)生頻率外，抗性菌株生物活性、適合度和藥劑交互抗性數(shù)據(jù)對(duì)后續(xù)用藥也具有重要指導(dǎo)意義，如發(fā)現(xiàn)核盤菌的啶酰菌胺抗性菌株適合度降低，且與萎銹靈存在正交互抗性[8]，則萎銹靈抗性菌株不可使用啶酰菌胺防治。FRAC基于不同的SDHI交互抗性模式、抗藥性變異頻率、抗藥性水平及適合度等因素，評(píng)估SDHIs的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)為中等至高等。因此，隨著SDHIs藥劑的使用時(shí)間延長(zhǎng)和應(yīng)用規(guī)模擴(kuò)大，抗性問題也將進(jìn)一步加重。1.2甲氧基丙烯酸酯抑制劑類甲氧基丙烯酸酯抑制劑（QoIs）類殺菌劑作用于呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ細(xì)胞色素氧化酶bc1復(fù)合物（泛醌氧化酶）外側(cè)，殺菌基團(tuán)是其分子上的甲氧基丙烯酸酯活性基團(tuán)。該類化合物抗菌譜廣，對(duì)半知菌、子囊菌、擔(dān)子菌和卵菌都有較好的抗菌活性。19世紀(jì)90年代，嘧菌酯和醚菌酯進(jìn)入市場(chǎng)，隨后肟菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯相繼上市。由于作用方式單一，QoIs極易產(chǎn)生抗藥性。QoIs上市2年后，德國(guó)北部地區(qū)發(fā)現(xiàn)小麥白粉病菌對(duì)醚菌酯產(chǎn)生抗性[9]，且抗性發(fā)展較快。此后，小麥赤霉病、白粉病、葉枯病，大麥網(wǎng)斑病，水稻紋枯病、稻瘟病，大豆褐斑等多種作物病害對(duì)該類藥劑表現(xiàn)出抗性[10]。在瓜果類作物中，霜霉病抗性問題比較嚴(yán)重。QoIs類殺菌劑在法國(guó)和意大利上市4年后即檢測(cè)到葡萄霜霉菌株對(duì)其產(chǎn)生抗性[11]。隨著用藥的不斷增加，葡萄霜霉病對(duì)QoIs類殺菌劑已經(jīng)發(fā)展出嚴(yán)重抗性，美國(guó)佐治亞州3個(gè)葡萄園39株葡萄霜霉菌株全部表現(xiàn)出抗性[12]。隨著藥劑的不斷擴(kuò)大使用，瓜類白粉病、果樹黑星病、瓜果炭疽病等病原菌也對(duì)QoIs產(chǎn)生抗性。研究發(fā)現(xiàn)，蘋果黑星病菌對(duì)嘧菌酯產(chǎn)生了嚴(yán)重抗性，抗性頻率為96.4%[13]。中國(guó)不同地區(qū)162株黃瓜靶斑病菌對(duì)吡唑醚菌酯均已產(chǎn)生較高抗性，且抗性菌株適合度比敏感菌株更高[14]。溫室中采集到的黃瓜褐斑病菌對(duì)QoIs類殺菌劑的抗性高達(dá)100%，且對(duì)6種QoIs藥劑表現(xiàn)出較強(qiáng)的正交互抗性[15]。不同的是，經(jīng)過多年的使用，QoIs類殺菌劑在田間銹病病菌中極少未進(jìn)化出抗藥性，原因是銹病抗性菌株發(fā)生氨基酸突變后適合度大大降低，不能在田間形成抗性群體。結(jié)合抗性產(chǎn)生和發(fā)展情況，F(xiàn)RAC將QoIs殺菌劑歸類為高抗性風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑。02、殺菌劑的抗性機(jī)制2.1琥珀酸脫氫酶類抑制劑SDHIs藥劑的作用靶標(biāo)為病原菌呼吸作用電子傳遞鏈上的復(fù)合體Ⅱ，由黃素蛋白（Fp，SdhA）、鐵硫蛋白（Ip，SdhB）和另外2種嵌膜蛋白（SdhC和SdhD）等4個(gè)亞基組成。目前，研究發(fā)現(xiàn)病原菌對(duì)SDHIs產(chǎn)生抗性主要是因?yàn)榘袠?biāo)復(fù)合物Ⅱ發(fā)生氨基酸突變。藥靶蛋白發(fā)生氨基酸突變后，與藥劑的結(jié)合受阻，親和力降低，從而使藥劑喪失殺菌作用。其中，大多數(shù)突變發(fā)生于SdhB、SdhC和SdhD，發(fā)生于SdhA的突變極少，具體可見表1?；颐共【l(fā)生SdhB-P225L、SdhC-G85A和I93V點(diǎn)突變后，對(duì)氟唑菌酰羥胺產(chǎn)生抗性[16]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，灰霉病菌SdhB亞基中與SDHIs抗性有關(guān)的突變?yōu)镻225F/L/T/H、N230I、H272R/Y/L/V[17]，SdhD亞基中為H132R[18]。286株鏈格孢霉對(duì)啶酰菌胺的抗性菌株基因中有11種突變，80%為SdhB的氨基酸突變（7種：H277Y/R/L，P230A/R，N235D/T），其余為SdhC（1種：H134R）、SdhD（3種：D123E，H133R/P）[19]。西瓜蔓枯病菌的氟唑菌酰羥胺抗性菌株同樣為SdhB（H277Y）突變[22]。有趣的是，同一種氨基酸突變會(huì)對(duì)不同的SDHI類藥劑產(chǎn)生不同的效果，如灰霉病菌SdhB（H272R）對(duì)除氟吡菌酰胺外的所有SDHIs均產(chǎn)生抗性，SdhB（H272Y）則產(chǎn)生氟吡菌酰胺超敏反應(yīng)[24]。這可能是因?yàn)椴煌乃巹┗瘜W(xué)基團(tuán)不同，藥靶氨基酸突變后與藥劑的結(jié)合模式差異較大，從而產(chǎn)生了截然不同的抗性結(jié)果。此外，發(fā)生在不同的真菌物種中的同源氨基酸突變也會(huì)產(chǎn)生不同的影響，如M.graminicola的P220位點(diǎn)突變和B.cinerea的P225位點(diǎn)突變[25]。除了氨基酸突變以外，靶標(biāo)的遺傳分化也會(huì)導(dǎo)致藥劑抗性。赤霉病菌存在2個(gè)SdhC的遺傳分化，降低了對(duì)SDHIs的敏感性。除赤霉病菌外，小麥葉枯病菌分化出一個(gè)SdhC的同源基因———alt-SDHC，該基因介導(dǎo)了對(duì)氟唑菌酰羥胺、氟吡菌酰胺等SHA-SDHIs亞類殺菌劑的天然抗性。Alt-SDHC與其他3個(gè)SDH亞基結(jié)合可產(chǎn)生功能齊全的酶，其蛋白中的獨(dú)特Qp位殘基賦予了SHA-SDHI抗性。歐洲小麥葉枯病菌群體中20%～30%菌株存在alt-Sdhc基因，且該基因的表達(dá)水平、剪切效率可直接影響菌株對(duì)氟唑菌酰羥胺等藥劑的抗性水平，這種現(xiàn)象表明了靶標(biāo)的分化對(duì)藥劑抗性的重要影響作用[26]。2.2甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑QoIs和SDHIs同屬于呼吸抑制劑，均結(jié)合于線粒體呼吸作用電子傳遞鏈上的復(fù)合物，但QoIs主要結(jié)合于復(fù)合物Ⅲ中細(xì)胞色素b（Cytb）的Qo位點(diǎn)，從而抑制氫醌與Qo位點(diǎn)的結(jié)合，中斷復(fù)合物Ⅲ的電子傳遞，使病原菌不能產(chǎn)生ATP，進(jìn)而造成能量代謝紊亂[27]。細(xì)胞色素b由線粒體DNA編碼，容易發(fā)生氨基酸突變產(chǎn)生抗藥性。已報(bào)道的病原菌對(duì)該類殺菌劑的抗性突變類型是G143A、F129L和G137R，表2統(tǒng)計(jì)了常見病原菌的抗性突變類型。第一種，G143A為核苷酸密碼子由GGT突變?yōu)镚CT，丙氨酸取代甘氨酸，藥劑與靶標(biāo)的結(jié)合能力受到較大影響，因此產(chǎn)生了高水平抗藥性。G143A在田間抗性菌株中十分常見，像蘋果黑星病菌27株抗性菌株均為G143A點(diǎn)突變[13]，黃瓜靶斑病菌162株抗性菌株中均檢測(cè)到了G143A點(diǎn)突變[14]。G143A引發(fā)的抗性倍數(shù)可高達(dá)數(shù)百倍，大大影響了QoIs單劑在田間的藥效[30]。菜豆銹菌等143位密碼子后存在內(nèi)含子，突變后抗性菌株不能在田間生存，因此很少有高水平抗藥性發(fā)生[31]。灰霉病菌存在143位密碼子后包含和不包含內(nèi)含子2種基因型，在QoIs藥劑廣泛使用后，自然界形成了G143A高水平抗藥性基因型病原菌群體[32]。第二種，苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼幔‵129L）使得Cytb空間上更靠近血紅素bL，干擾QoIs殺菌劑毒性基團(tuán)發(fā)揮作用，進(jìn)而產(chǎn)生高水平抗性，但抗藥性水平略低于G143A。F129L抗藥性變異對(duì)致病性的影響比較大[28]。第三種，甘氨酸被精氨酸取代（G137R）產(chǎn)生的抗性多為低抗和中抗，且抗性變異的適合度代價(jià)較大，難以在田間存活。除氨基酸突變外，旁路氧化途徑（又名替代氧化途徑）也是導(dǎo)致QoIs產(chǎn)生抗性的重要原因之一。旁路氧化途徑指的是電子從NADH經(jīng)FMN、Fe-S、UQ、FP，由旁路氧化酶（AOX）傳至氧，該過程不經(jīng)過復(fù)合物Ⅲ。很多真菌的AOX為誘導(dǎo)表達(dá)型，即正常條件下表達(dá)水平很低或者不表達(dá)，但如果以細(xì)胞色素為介導(dǎo)的呼吸途徑被阻斷或線粒體蛋白的合成受到抑制，AOX則會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)[27]。嘧菌酯、肟菌酯都可激活甜橙炭疽病菌的旁路氧化途徑，從而導(dǎo)致抗性增加[33]。旁路氧化途徑合成的ATP只是經(jīng)過復(fù)合物III合成能量的40%，因此通過增加旁路氧化酶活性而表現(xiàn)抗藥性的菌株適合度低，不是生產(chǎn)實(shí)際中產(chǎn)生抗藥性的主要機(jī)制。03、殺菌劑的抗藥性監(jiān)測(cè)目前，化學(xué)防治仍是防控真菌病害最有效的方法。由于病原微生物具有較高的繁殖率，在藥劑選擇壓力下，少數(shù)抗藥性突變菌株在較短時(shí)間內(nèi)就可能通過侵染和繁殖形成抗藥性群體，導(dǎo)致殺菌劑突然失效，防控措手不及，造成重大損失。因此，抗藥性群體發(fā)展態(tài)勢(shì)監(jiān)測(cè)及早期預(yù)警十分重要?？顾幮员O(jiān)測(cè)和治理大概可分為4個(gè)階段[9]：第一步是在殺菌劑投入市場(chǎng)之前，在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定病原菌對(duì)藥劑的敏感性，建立敏感基線。通過敏感基線可以比較不同病原菌對(duì)殺菌劑敏感性的時(shí)空變化，有利于掌握病原菌抗性發(fā)展動(dòng)態(tài)[34]。從實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)中評(píng)估藥劑的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，制定藥劑的初步使用策略。第二步是在殺菌劑前期使用階段，此階段可能會(huì)出現(xiàn)一些抗性個(gè)例。采集田間抗性菌株，確定是否產(chǎn)生抗性、與其他藥劑是否有交互抗性及適合度變化等問題，調(diào)整藥劑使用策略并加強(qiáng)抗藥性監(jiān)測(cè)。第三步是在抗性問題比較普遍情況下，通過抗性監(jiān)測(cè)認(rèn)識(shí)到抗性的傳播速度、發(fā)展速度，探究抗性機(jī)制，進(jìn)一步調(diào)整藥劑使用策略（多分為繼續(xù)使用和禁用2種）。第四步指的是藥劑被禁用的情況下，繼續(xù)監(jiān)測(cè)病原菌的抗性發(fā)展情況，為同類藥劑的使用提供理論參考。傳統(tǒng)的抗藥性監(jiān)測(cè)方法主要是敏感性測(cè)定和區(qū)分劑量法[35]。敏感性測(cè)定指的是通過菌絲生長(zhǎng)速率法或孢子萌發(fā)法將病原菌放置到含藥培養(yǎng)基或噴灑藥劑的植物組織上，檢測(cè)病原菌對(duì)藥劑的敏感性。該方法通過計(jì)算EC50值（引起群體50%個(gè)體死亡的藥劑濃度）確定病原菌的抗性水平，計(jì)算抗性頻率，判斷抗性產(chǎn)生情況，評(píng)估該群體的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。區(qū)分劑量法指的是通過測(cè)定病原菌對(duì)藥劑的EC50值和MIC值（藥劑完全抑制病原菌生長(zhǎng)的最小濃度），確定一個(gè)鑒別劑量，以病原菌是否可以在該濃度生長(zhǎng)來判斷其敏感或抗性[9]。傳統(tǒng)方法主要適用于抗性機(jī)制還不完全明確的藥劑，比如檢測(cè)番茄灰霉病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的抗性[36]。該方法對(duì)病原菌的抗性檢測(cè)是比較準(zhǔn)確和靈敏的，但是過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，工作量比較大，不適合在田間展開。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)代分子檢測(cè)法開始被應(yīng)用。第一類方法為基于核酸檢測(cè)水平的分子技術(shù)，通過檢測(cè)已知的抗性位點(diǎn)來判斷抗性發(fā)展情況。單核苷酸多態(tài)性（SNPs），是指由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)[9]，是研究生物遺傳變異的重要依據(jù)。由于藥劑靶標(biāo)發(fā)生氨基酸突變而產(chǎn)生的抗性，可通過SNPs相關(guān)技術(shù)被監(jiān)測(cè)到，具體可包括Simoes等[23]利用物種特異性RT-PCR定性、定量檢測(cè)引發(fā)大豆銹病病菌對(duì)SDHIs抗性的C-I86F突變；Battistini等[37]采用微滴數(shù)字PCR檢測(cè)引發(fā)小麥葉枯病菌對(duì)QoIs抗性的典型突變G143A；Samaras等[17]應(yīng)用高分辨率熔解（HRM）可快速識(shí)別對(duì)SDHIs有抗性的B.cinerea病菌SdhB上的P225H/F/L/T、N230I、H272L/R/Y突變[17]；利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)可以監(jiān)測(cè)和評(píng)估B.cinerea對(duì)QoIs藥劑的抗性發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)[38-39]，而且不受實(shí)驗(yàn)設(shè)備的限制，能夠直接用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)[40]也可以實(shí)現(xiàn)抗性監(jiān)測(cè)等。第二類方法為分析靶標(biāo)蛋白與藥劑的結(jié)合方式，如分子對(duì)接法，該方法是基于相關(guān)軟件模擬靶標(biāo)蛋白與藥劑的結(jié)合，通過各個(gè)參數(shù)預(yù)測(cè)二者的結(jié)合方式和結(jié)合能力，從而推斷出抗性機(jī)制。陶麗紅等[41]利用分子對(duì)接研究了5種SDHIs與灰葡萄孢菌SDH的結(jié)合模式，并分析了氨基酸突變導(dǎo)致結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)變化。綜上比較可得，分子檢測(cè)技術(shù)相比于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)速度快，可批量檢測(cè)大批樣本，但適用范圍有限，成本比較高。04、殺菌劑的抗藥性治理田間出現(xiàn)抗藥性主要是因?yàn)殚L(zhǎng)期頻繁使用同一種作用機(jī)制的藥劑，病原菌長(zhǎng)期受到同一種篩選壓力，便容易進(jìn)化出抗性群體。因此，抗藥性治理最重要的措施是合理規(guī)范用藥。我們應(yīng)充分了解病害的發(fā)生特點(diǎn)、藥劑的作用機(jī)理和抗性監(jiān)測(cè)情況，保證藥效的同時(shí)減少抗性群體的產(chǎn)生。在藥劑的選擇上，應(yīng)考慮防治對(duì)象的特性、不同殺菌劑作用機(jī)制的差異、抗性機(jī)制的差異、抗性群體的生物學(xué)特性和適合度變化等因素。關(guān)于防治對(duì)象，明確病原菌的抗性風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，像小麥白粉病菌、灰霉病菌為高風(fēng)險(xiǎn)病原菌，小麥紋枯病菌為中風(fēng)險(xiǎn)病原菌，銹病菌為低風(fēng)險(xiǎn)病原菌，再結(jié)合藥劑特點(diǎn)進(jìn)行組合用藥。關(guān)于藥劑的選用，應(yīng)考慮藥劑作用機(jī)制和抗性機(jī)制，明確所用藥劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)。避免使用FRAC中同一個(gè)亞類的藥劑，因?yàn)橥粊嗩惖乃巹┒嘤薪换タ剐裕ù蠖鄶?shù)SDHIs有正交互抗性；QoIs中代碼11的嘧菌酯、丁香菌酯、醚菌胺等有正交互抗性），建議使用無交互抗性（QoIs中代碼11和代碼11A）或有負(fù)交互抗性的藥劑；限制同一類作用機(jī)制藥劑的使用量，將不同作用機(jī)制的藥劑復(fù)配使用，目前藥劑混用多分為交替使用和混合使用2種，研究表明混合使用時(shí)效果更好[42]；對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性的病原菌，根據(jù)其抗性特點(diǎn)合理