玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展

玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展

玉米不僅是重要的糧食和飼料材料，也是現(xiàn)代工業(yè)的重要原料。隨著畜牧業(yè)、工業(yè)的發(fā)展以及世界人口的增長,玉米在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有越來越重要的地位,1998年以來,玉米已超過水稻和小麥成為全球第一大作物。建國以來,我國玉米播種面積、單產(chǎn)和總產(chǎn)量都呈持續(xù)增長趨勢,2002年我國玉米播種面積超過小麥而僅次于水稻,玉米單產(chǎn)由1123.1kg/hm2增加到5394.0kg/hm2,超過世界玉米平均單產(chǎn)水平,2006年玉米總產(chǎn)量達(dá)到1.45億t,但與美國等玉米生產(chǎn)大國還存在較大差距。據(jù)相關(guān)研究推測,到2020年世界玉米需求量將達(dá)到7.53億t,屆時(shí)中國玉米需求量為2.14億t。因此,玉米總需求量的不斷攀升使得玉米生產(chǎn)面臨巨大挑戰(zhàn)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)使優(yōu)良的基因在動(dòng)植物和微生物之間進(jìn)行交流,彌補(bǔ)某些遺傳資源的不足,豐富種質(zhì)庫。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究首先在煙草上獲得成功,隨之在農(nóng)業(yè)上取得了巨大進(jìn)展。2008年全球商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因作物主要涉及大豆、玉米、棉花和油菜等,總種植面積已達(dá)1.25億hm2,與1996年產(chǎn)業(yè)化初始階段的170萬hm2相比增長了74倍,12年累計(jì)種植面積已超過8億hm2。玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究始于1986年,隨著研究的深入,在降低轉(zhuǎn)化受體依賴性、提高轉(zhuǎn)化效率、提出新型轉(zhuǎn)化方法等方面取得了重要的進(jìn)展。本文概述了玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究現(xiàn)狀及其在玉米遺傳改良中的應(yīng)用,展望了玉米轉(zhuǎn)基因的研究方向。1玉米轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究現(xiàn)狀1.1穩(wěn)定基因的轉(zhuǎn)化高效植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn):轉(zhuǎn)化方法不受基因型限制,且便于操作;受體組織具有較強(qiáng)的分化和再生能力;構(gòu)建適宜的植物表達(dá)載體;篩選方法高效、可靠,易獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化事件;轉(zhuǎn)基因植株的分子和遺傳特性要有穩(wěn)定、高效的基因表達(dá)。植物轉(zhuǎn)基因方法基本分為三大類:一是載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化,如農(nóng)桿菌法等;二是DNA直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化,包括基因槍法、聚乙二醇(PEG)法、電激穿孔法、超聲波介導(dǎo)法、碳化硅纖維介導(dǎo)法和顯微注射法等;三是種質(zhì)轉(zhuǎn)化,主要是花粉管通道法和子房注射法。目前,玉米轉(zhuǎn)基因方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法,此外還有花粉管通道法。1.1.1高效農(nóng)桿菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米系統(tǒng)土壤農(nóng)桿菌中的根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌均為革蘭氏陰性菌,同屬根瘤菌科,可以侵染雙子葉植物和部分單子葉植物。農(nóng)桿菌是一種自然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng),能轉(zhuǎn)移一些相對較大的DNA片段,具有操作簡單、成本低和整合位點(diǎn)較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化主要過程,如圖1所示:農(nóng)桿菌吸附在植物敏感細(xì)胞上;農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的Vir區(qū)域被激活;T-DNA切割和T-DNA復(fù)合物的形成;T-DNA復(fù)合物進(jìn)入植物細(xì)胞;T-DNA整合到植物染色體上并表達(dá)。Grimsley等于1987～1989年報(bào)道了MSV(MaizestreakVirus)基因的根癌農(nóng)桿菌可以感染玉米葉片,且生長點(diǎn)部位最易被感染,但沒有證明病毒DNA整合入玉米的基因組;1991年,Gould等用農(nóng)桿菌侵染玉米芽尖,得到轉(zhuǎn)基因植株,為建立玉米高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ);1996年,Ishida等報(bào)道了用農(nóng)桿菌侵染A188自交系幼胚的轉(zhuǎn)化率為12%～30%;1999年,先鋒公司Zhao等獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米骨干自交系幼胚的專利。Ishida等和Hiei等也分別報(bào)道了利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因玉米植株,并證明外源基因能夠穩(wěn)定表達(dá)和遺傳。然而,在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米體系中,表達(dá)載體類型、農(nóng)桿菌濃度、受體的基因型、共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)溫度和篩選方式等都會(huì)影響玉米的轉(zhuǎn)化效率。目前,農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究主要集中于單基因轉(zhuǎn)化,但玉米的許多性狀是由多個(gè)基因控制的,因此利用新技術(shù)尋找更多有用基因,探索農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米多基因轉(zhuǎn)化以及無標(biāo)記轉(zhuǎn)化是當(dāng)前研究的方向。1.1.2玉米植株的生長特性基因槍法由美國Cornell大學(xué)的Sanford等研究提出。1987年,Klein等首次將基因槍法應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因研究,并于1989年第一次使用基因槍法轉(zhuǎn)化玉米獲得成功,Gordon-Kamm等用同樣的方法獲得可育的轉(zhuǎn)基因玉米植株。近些年,隨著基因槍轉(zhuǎn)化法在玉米遺傳轉(zhuǎn)化中的不斷發(fā)展和完善,轉(zhuǎn)化效率得到明顯提高。研究發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)化過程中加入氯化鈣和亞精胺能提高核酸與微彈的結(jié)合力,選擇合適的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體及受體組織,優(yōu)化基因槍轟擊參數(shù)(轟擊次數(shù)、轟擊時(shí)金粉用量、轟擊距離、DNA濃度、氦氣壓力和微彈速度等)可有效提高基因槍的轉(zhuǎn)化效率?；驑尫ň哂惺荏w廣泛、不受基因型限制、便于操作等優(yōu)點(diǎn)。但是基因槍法在轟擊過程中容易導(dǎo)致骨架載體的插入、DNA斷裂和多拷貝整合等。另外,外源基因是隨機(jī)整合的,會(huì)造成外源基因在表達(dá)水平上存在一定的差異,甚至可能導(dǎo)致基因沉默?；驑尫ㄒ殉晒?yīng)用于玉米、水稻、小麥、棉花和大豆等許多農(nóng)作物的品種改良上,并且該技術(shù)被用于瞬間表達(dá)研究和培育穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株等研究領(lǐng)域。1.1.3玉米葉片基因的轉(zhuǎn)化花粉管通道法由我國學(xué)者周光宇等創(chuàng)立,其原理是植物授粉后,將外源DNA沿著花粉管滲入,經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊,轉(zhuǎn)化卵細(xì)胞或受精細(xì)胞的早期胚胎細(xì)胞?；ǚ酃芡ǖ婪ㄗ鳛橐环N頗具特色的轉(zhuǎn)基因技術(shù),無需建立原生質(zhì)體和愈傷組織培養(yǎng)體系,無基因型限制和易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn),加之玉米是穗狀花序,小花叢生,具有發(fā)達(dá)的有性繁殖系統(tǒng),每穗結(jié)實(shí)粒多,花粉易于采集,體外存活時(shí)間長等有利因素,使得花粉管通道法具有便利的條件。Dowet等用花粉管通道法轉(zhuǎn)化玉米葉斑病基因得到轉(zhuǎn)基因植株。Ohta等將外源DNA溶液與花粉?；旌虾罅⒓词诜?獲得了高頻率的轉(zhuǎn)化。Langridge等和Wang等也分別成功地將外源DNA導(dǎo)入到玉米植株中。研究發(fā)現(xiàn)花粉管通道法受DNA導(dǎo)入時(shí)間、DNA溶液濃度和抗除草劑篩選濃度等因素的影響。目前,花粉管通道法已應(yīng)用于棉花、水稻、小麥、大豆和玉米等農(nóng)作物的改良和育種工作。1.2玉米原生質(zhì)體的基因表達(dá)玉米基因轉(zhuǎn)化的成功首先依賴于建立良好的受體系統(tǒng),玉米轉(zhuǎn)基因的有效受體主要包括四種:一是愈傷組織。外植體經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織,再經(jīng)過分化培養(yǎng)獲得再生植株。外植體主要來自于玉米幼胚、成熟胚、分裂的玉米種子,幼穗或幼苗頂芽分生組織等;二是原生質(zhì)體。由于有可行的物理或化學(xué)方法(如電擊法和PEG法等)使外源DNA能有效地通過玉米裸露的原生質(zhì)體膜,原生質(zhì)體再生系統(tǒng)在上世紀(jì)80年代就大量用于玉米的轉(zhuǎn)化,是最早用于玉米轉(zhuǎn)基因的受體;三是種質(zhì)。種質(zhì)受體指玉米自身的生殖系統(tǒng),如花粉?；蚵鸭?xì)胞,也稱生殖細(xì)胞受體系統(tǒng),主要應(yīng)用在花粉管通道法和子房注射法。由于種質(zhì)受體以生殖細(xì)胞直接作為受體細(xì)胞,外源基因?qū)牒髸?huì)隨著正常的受精過程而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化,因此,是很有潛力的受體系統(tǒng);四是直接分化。直接分化指葉片、幼莖等外植體細(xì)胞越過脫分化產(chǎn)生愈傷組織而直接分化出不定芽獲得再生植株。玉米莖尖是比較好的直接分化再生系統(tǒng),Zhong等用莖尖培養(yǎng)產(chǎn)生了叢生不定芽,基因槍轟擊得到了轉(zhuǎn)化植株,特別是其建立了一種新的受基因型限制小的玉米叢生芽離體培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng),能快速有效地獲得大批轉(zhuǎn)基因植株。鞏健等和孫傳波等分別以玉米莖尖為受體獲得了轉(zhuǎn)基因玉米植株,豐富了轉(zhuǎn)化的受體基因型。1.3標(biāo)記基因序列玉米轉(zhuǎn)基因研究中使用高效表達(dá)載體對提高目的基因的轉(zhuǎn)化效率和表達(dá)至關(guān)重要。用于玉米遺傳轉(zhuǎn)化的雙元表達(dá)載體一般具有以下共同特點(diǎn):(1)細(xì)菌的復(fù)制起始位點(diǎn);(2)在原核生物中表達(dá)的選擇標(biāo)記基因;(3)多克隆位點(diǎn);(4)植物細(xì)胞中表達(dá)的標(biāo)記基因。轉(zhuǎn)基因玉米研究中廣泛使用的啟動(dòng)子有CaMV35S、Actin、Ubiquitin及組蛋白和非組蛋白染色體蛋白基因、核糖蛋白基因或其他“持家”基因的啟動(dòng)子以及玉米特異性啟動(dòng)子Globulinl。此外,考慮到轉(zhuǎn)基因作物中標(biāo)記基因的安全性,玉米轉(zhuǎn)基因育種中標(biāo)記基因的刪除將成為研究熱點(diǎn),位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)之一的Cre/loxP系統(tǒng)是應(yīng)用較多且較成熟的一個(gè)標(biāo)記基因刪除系統(tǒng)。研究表明植物病毒載體系統(tǒng)有三種:(1)單鏈RNA植物病毒載體系統(tǒng);(2)單鏈植物DNA病毒載體系統(tǒng);(3)雙鏈DNA植物病毒載體系統(tǒng),用這樣重組的病毒載體感染植物細(xì)胞以獲得外源基因的轉(zhuǎn)移。病毒介導(dǎo)法載體比較小,便于在實(shí)驗(yàn)中操作,而且這類載體只要與植物細(xì)胞共培養(yǎng)就可以較高地感染植物細(xì)胞,外源基因能在植物細(xì)胞中快速復(fù)制和高水平表達(dá),但是病毒載體應(yīng)用于玉米遺傳轉(zhuǎn)化還有待深入研究。2冷反應(yīng)、改造和轉(zhuǎn)染玉米農(nóng)藝性狀1996～2009年全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積占全球轉(zhuǎn)基因作物總面積的百分比穩(wěn)定增長(圖2)。目前,轉(zhuǎn)基因玉米農(nóng)藝性狀改良主要涉及抗除草劑、抗蟲、抗病、抗旱和品質(zhì)改良等,商業(yè)化種植面積較多的是抗除草劑、抗蟲和二者復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米(表1)。毫無疑問,轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米生產(chǎn)中將發(fā)揮越來越重要的作用。2.1抗機(jī)構(gòu)生物基因制備抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米是高效、低成本控制雜草的新途徑。目前,國內(nèi)已經(jīng)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得具有潛在利用價(jià)值的抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米新材料(表2),其抗除草劑基因主要來源于細(xì)菌等微生物。國外已商業(yè)化種植了一批抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米品種(表3),其中NK603已經(jīng)在中國獲得了30項(xiàng)專利保護(hù)(中國專利局?jǐn)?shù)據(jù)庫)。2.2抗蟲基因檢測蟲害是造成玉米減產(chǎn)的主要因素之一,世界范圍內(nèi)玉米害蟲達(dá)350多種,其中以蛀莖性和食葉性的歐洲玉米螟(ECB,Ostrinianubilalis)和亞洲玉米螟(ACB,O.furnacalis)最為嚴(yán)重。在玉米生產(chǎn)中通常使用化學(xué)農(nóng)藥來控制蟲害,但也帶來了一些負(fù)面問題:(1)玉米中有農(nóng)藥殘留;(2)害蟲逐步產(chǎn)生抗藥性;(3)化學(xué)農(nóng)藥作用方式是非特異性的,殺死害蟲的同時(shí)也使其天敵受害,從而危及多種生物資源。而抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米能克服上述農(nóng)藥帶來的不利因素。Schnepf等于1981年首次從蘇云金芽孢桿菌克隆了一個(gè)編碼殺蟲晶體蛋白的Bt基因,該Bt蛋白與昆蟲中腸柱狀上皮細(xì)胞的刷狀紋緣膜特異性結(jié)合,毒蛋白全部或部分嵌合于細(xì)胞膜中,導(dǎo)致細(xì)胞由于滲透平衡破壞而溶解,從而最終影響昆蟲的存活、生長、發(fā)育和繁殖等。Bt蛋白的發(fā)現(xiàn)揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。1996年,美國已正式批準(zhǔn)Bt基因玉米進(jìn)入商品化生產(chǎn),到目前已經(jīng)商業(yè)化種植了多個(gè)抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米品種(表3),其中MON810在中國已經(jīng)獲得了3項(xiàng)專利保護(hù)。目前,來源于微生物的抗蟲基因是目前商業(yè)化應(yīng)用最有效基因之一。近年來,研究人員在嘗試克隆植物來源的抗蟲轉(zhuǎn)基因代替微生物來源基因,主要涉及的基因有:(1)蛋白酶抑制劑抗蟲基因,如豇豆胰蛋白抑制劑基因(SCK)和豇豆胰蛋白抑制劑基因(CpTI)等。(2)植物外源凝集素(Lectin)基因,如雪花蓮凝集素基因(GNA)和半夏凝集素基因(pta)等(表4)。另外,開發(fā)新型微生物來源的高效抗蟲基因已成為目前研究的熱點(diǎn)之一,如Cry系列的其他基因。2.3玉米抗性育種的研究玉米生長期間常受到病毒性病害(矮花葉病、玉米粗縮病等)、真菌性病害(玉米紋枯病)和細(xì)菌性病害等侵襲而使其品質(zhì)及產(chǎn)量下降。常規(guī)育種由于抗原的缺乏和不同物種間的遺傳隔離,使抗病育種工作受到了極大的限制,然而,研究抗病轉(zhuǎn)基因玉米可以為玉米抗病育種提供新的種質(zhì)(表5)。目前,玉米抗病轉(zhuǎn)基因研究多為單個(gè)抗病基因的轉(zhuǎn)化,挖掘新的抗病基因,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)多抗病基因的聚合轉(zhuǎn)化,培育多抗玉米材料將成為玉米抗病分子育種的發(fā)展趨勢。2.4玉米相關(guān)基因我國水資源緊缺,干旱和半干旱耕地面積多,還有大片的鹽漬土壤,因此,培育抗旱、耐鹽轉(zhuǎn)基因玉米新品種對提高作物的單位面積產(chǎn)量和擴(kuò)大種植區(qū)域尤為重要?？购怠⒛望}轉(zhuǎn)基因研究大體涉及以下幾類基因:(1)編碼滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及逆境中保護(hù)細(xì)胞的基因,如超氧化物歧化酶基因(MnSOD)、海藻糖合成酶基因(TPS1)和膽堿脫氫酶基因(betA)等。(2)細(xì)胞膜上離子排運(yùn)基因,如Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(NHX1)和液泡膜上焦磷酸酶基因(PPase)和TsVP基因等。Li等將TsVP基因轉(zhuǎn)入玉米自交系掖478,結(jié)果表明可以提高玉米的耐旱性。(3)抗逆相關(guān)的調(diào)控基因,如DREB基因和TsCBF1基因等(表6)。目前,孟山都公司宣布其研究開發(fā)的抗旱轉(zhuǎn)基因玉米已經(jīng)進(jìn)入實(shí)用階段,預(yù)計(jì)將于2010年以后投入市場。2.5玉米基因的改良隨著人們生活水平的不斷提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變,玉米品質(zhì)改良顯得尤為重要。此外,玉米作為飼料和主要工業(yè)原料使得特用玉米品質(zhì)改良逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。因此,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因或人工合成的高蛋白基因?qū)胗衩讈砀牧加衩椎臓I養(yǎng)品質(zhì)將成為研究熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明,玉米淀粉分支酶基因(sbe2a)、高賴氨酸蛋白質(zhì)基因、O2基因、a-lactalbumin基因、cyMDH基因、植酸酶基因(phy)等已用來改良玉米品質(zhì)。關(guān)淑艷等用花粉管通道法將sbe2a導(dǎo)入玉米自交系鐵7922,提高了玉米胚乳中直鏈淀粉的含量。Bicar等用基因槍法將a-lactalbumin基因?qū)胗衩鬃越幌礖iII,提高了玉米胚乳中玉米醇溶蛋白的含量。丁明忠等利用花粉管通道法和減壓滲透法將大豆總DNA導(dǎo)入玉米,篩選到8個(gè)高蛋白材料,玉米種子中蛋白質(zhì)含量比對照提高20%。此外,將phy轉(zhuǎn)入玉米可以降解其體內(nèi)的磷酸,提高可利用無機(jī)磷的含量及其玉米的品質(zhì)。另外,與水稻、小麥和大豆等作物相比,玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良品質(zhì)的研究仍處于初始階段。Song等克隆了控制水稻粒重的數(shù)量性狀基因GW2,其功能缺失或降低可以顯著增加水稻谷粒的寬度、加快子粒灌漿速度來增加粒重。孟超敏等用基因槍法將賴氨酸合成關(guān)鍵酶基因DapA導(dǎo)入小麥可提高小麥的賴氨酸含量,實(shí)現(xiàn)品質(zhì)改良。馬建等研究了以大豆脂肪氧化酶基因(Lx1、Lx2、Lx3)為靶基因,利用RNA干擾技術(shù)抑制其表達(dá),降低大豆子粒中脂肪氧化酶活性及含量,創(chuàng)制了優(yōu)良大豆種質(zhì)新資源。因此,借鑒這些作物同源基因的研究對今后玉米轉(zhuǎn)基因研究將起到推動(dòng)作用。2.6基因型與分子鑒定玉米轉(zhuǎn)基因研究還涉及雄性不育和生物反應(yīng)器等方面。Mariani等將來自煙草花藥絨氈層特異啟動(dòng)子TA29與核酸酶基因Barnase融合后轉(zhuǎn)化玉米并成功獲得雄性不育植株。Gadab等用基因槍法將纖維素1,4-D-葡聚糖內(nèi)切酶基因轉(zhuǎn)入玉米自交系HiII使其能夠“生產(chǎn)”出具有生物活性纖維素酶,為實(shí)現(xiàn)綠色生物反應(yīng)器生產(chǎn)廉價(jià)和高質(zhì)量的纖維素酶成為可能。3針對玉米育種研究的問題和現(xiàn)狀3.1水稻基因組的整合玉米轉(zhuǎn)基因研究的下一個(gè)目標(biāo)是發(fā)展更有效的技術(shù)以高效地轉(zhuǎn)移并同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因。有研究表明,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將相關(guān)外源基因(psy,lcy,crtI)整合到水稻基因組中,培育出胚乳中富含β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)基因水稻品種,食用后可滿足人體每天所需VA,由于其稻米外觀顏色為黃色,也被稱為“黃金米”。玉米中約有20個(gè)基因影響玉米花色素的產(chǎn)生,其中8個(gè)基因[r(包括Lc、Sn)、b、c1、pl、p、vpl、in1和pac1]的調(diào)節(jié)功能已得到鑒定。因此,發(fā)展玉米多基因轉(zhuǎn)化和基因聚合技術(shù)改良玉米品質(zhì),使其具有復(fù)合性狀是今后玉米分子育種的明顯特點(diǎn),目前國外復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米發(fā)展最快的是抗蟲性狀和抗除草劑性狀復(fù)合品種(表7)。3.2無選擇標(biāo)記的冷卻劑選育轉(zhuǎn)基因植物安全性問題涉及目的基因以及整合進(jìn)植物基因組中的轉(zhuǎn)化載體序列,而后者主要包含了篩選標(biāo)記的安全性。玉米轉(zhuǎn)基因載體常采用選擇標(biāo)記基因如抗生素或除草劑抗性基因,表達(dá)上述標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞對相應(yīng)的抗生素或除草劑產(chǎn)生抗性,但這些化學(xué)篩選劑會(huì)抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長和再生而降低轉(zhuǎn)化率。近年來這些選擇標(biāo)記基因?qū)ι鷳B(tài)系統(tǒng)和人類健康的影響已引起公眾的關(guān)注。鑒于這些因素,培育無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因玉米植株已成為重要目標(biāo)。從轉(zhuǎn)基因玉米植株中剔除選擇標(biāo)記基因或無選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化是目前獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的主要策略。從轉(zhuǎn)基因植株中剔除選擇標(biāo)記基因常用的策略是通過位點(diǎn)特異性重組將選擇標(biāo)記基因切除,具體有Cre/loxP系統(tǒng)、共轉(zhuǎn)化法、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和染色體內(nèi)重組等方法。3.3基因打靶技術(shù)通過遺傳轉(zhuǎn)化將目的基因?qū)胫参锘蚪M這一過程是個(gè)隨機(jī)事件。由于目的基因在植物基因組中的位置效應(yīng)其功能往往受到較大影響?；虼虬屑夹g(shù)是在同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞(ES)技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生和發(fā)展起來的。基因定點(diǎn)重組技術(shù)是20世紀(jì)80年代后興起的建立在基因同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種分子生物學(xué)技術(shù)。所謂基因打靶技術(shù)是將攜帶有選擇標(biāo)記的外源目的基因采用一定的方法導(dǎo)入受體細(xì)胞,再通過外源DNA序列與受體細(xì)胞染色體上同源DNA序列間發(fā)生重組,最終將外源DNA定點(diǎn)整合到受體細(xì)胞基因組某一確定的位點(diǎn),或?qū)δ骋活A(yù)先確定的受體位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,導(dǎo)致受體細(xì)胞基因功能敲除或者點(diǎn)突變發(fā)生的技術(shù)。Paszkowski等首次將基因打靶技術(shù)應(yīng)用于煙草轉(zhuǎn)基因研究