第3章-細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第3章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)

掃描遂道顯微鏡

(Scanningtunnelingmicroscope)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserConfocalMicroscopy）熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)1、普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)顯微鏡結(jié)構(gòu)：①機(jī)械部分：鏡座、鏡柱、鏡臂鏡筒、調(diào)焦裝置、載物臺（物鏡轉(zhuǎn)換器）②照明部分：反光鏡、聚光鏡③光學(xué)部分：目鏡、物鏡

放大倍數(shù)(magnification):最終成像的大小與原物體大小的比值?？偡糯蟊稊?shù)=物鏡放大倍數(shù)×目鏡放大倍數(shù)光學(xué)顯微鏡的最大放大倍數(shù)為1,000倍.電子顯微鏡的最大放大倍數(shù)為1,000,000.普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)分辨率（即分辨極限,D）是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離。習(xí)慣說的分辨率高則是指該分辨極限小；人眼的分辨率：100

m，光學(xué)顯微鏡的最大分別率：0.2

m。放大倍數(shù):光學(xué)顯微鏡在用空氣作介質(zhì)時，最大放大倍數(shù)為1000倍，用油鏡時為1400倍。分辨率（Limitofresolution）對可見光來說，能清楚分辨出相鄰兩點之間的最小間隔為0.2

m。

＝0.61×0.5m/1.5×1＝0.2

mP50數(shù)值孔徑幾種介質(zhì)的折射率不同光線的波長下列()與顯微鏡能達(dá)到的分辨率無關(guān)。A．光波波長B．物鏡的放大倍數(shù)C．標(biāo)本和透鏡之間的物質(zhì)的折射率D．透鏡的數(shù)值孔徑√固定（甲醛等）

↓包埋（石蠟、樹脂等）

↓切片（切片機(jī)）

↓染色觀察石蠟切片

石蠟切片

相差顯微鏡原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差變成振幅差，表現(xiàn)為明與暗的對比。兩個特殊構(gòu)件：環(huán)狀光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annularphaseplate）：涂有光吸收物質(zhì)和相位推遲物質(zhì)。用途：能觀察無色、透明、活細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)。微分干涉顯微鏡HumanCheekEpithelialCells

微分干涉顯微鏡原理：利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。

應(yīng)用：適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器、顆粒及其運動。計算機(jī)輔助的DIC分辨率比普通光鏡提高了一個數(shù)量級。應(yīng)用這一原理制備的錄像增差顯微鏡（video-enhancemicroscopy）可以觀察微管上顆粒的運動。C.elegans(線蟲)expressingGFP,visualizedunderdifferentialinterferencecontrastmicroscopy(top)andfluorescencemicroscopy(bottom).

熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）EthidiumPEcis-ParinaricacidTexasRedPE-TRConj.PIFITC600nm300nm500nm700nm400nm350632488波長熒光染料熒光顯微鏡技術(shù)免疫熒光技術(shù)（見本章第2節(jié)）熒光素直接標(biāo)記技術(shù)熒光素直接標(biāo)記技術(shù)TheadherentcultureofBPAEcellsfeaturedinthissectionwaslabeledwithMitoTrackerRedCMXRos(mitochondria;yellow),AlexaFluor488(filamentousactin;green),AlexaFluor647(nuclearporecomplexprotein;red),andHoechst33342(nucleus;cyan).

2008年諾貝爾化學(xué)獎

日本科學(xué)家下村修、美國科學(xué)家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢永健獲得2008年的諾貝爾化學(xué)獎。這三位科學(xué)家因在發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）方面做出貢獻(xiàn)而獲獎。2008年美國科學(xué)家培育出世界首只能“發(fā)光”的貓

隨著病毒在宿主體內(nèi)不斷擴(kuò)散，就可以通過跟蹤發(fā)出的綠光來觀察病毒的擴(kuò)散途徑

使用綠色熒光蛋白跟蹤大腦細(xì)胞的活動

大腦彩虹圖獲得了2007奧林巴斯生物數(shù)字成像大獎

綠色熒光蛋白

(greenfluorescentprotein)定義：綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡稱GFP，這種蛋白質(zhì)最早是在水母中發(fā)現(xiàn)，其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)會發(fā)出綠色熒光。在生物學(xué)領(lǐng)域中，綠色螢光蛋白基因常被用作為一個報告基因(reportergene)。

激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)（ConfocalLaserScanningMicroscope）采用激光束做光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點進(jìn)行掃描，然后激發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時產(chǎn)生聚焦，聚焦后的光被光電倍增管探測收集，并將信號輸送到計算機(jī)，在彩色顯示器上顯示圖像。laserconfocalscanningmicroscope,LCSM優(yōu)點1：圖像清晰優(yōu)點2：多重?zé)晒鈽?biāo)記Golgiapparatus(inred)andthemitoticspindles(ingreen)ofanearlyDrosophila（果蠅）embryoundergoingmitosis.

cytoskeletonmicrotubules(green),actinfilaments(red),andthenucleus(blue).

優(yōu)點3：觀察三維空間結(jié)構(gòu)在顯微鏡載物臺上加一個微量步進(jìn)馬達(dá)，使載物臺上下移動，改變焦平面，不同層次的光切面圖像經(jīng)計算機(jī)圖像三維重組，就可以無損傷地分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)。優(yōu)點3：觀察三維空間結(jié)構(gòu)優(yōu)點4：活細(xì)胞的動態(tài)觀察優(yōu)點4：活細(xì)胞的動態(tài)觀察熒光共振能量轉(zhuǎn)移P54

fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET當(dāng)一個供體熒光分子的熒光光譜與另一個受體熒光分子的激發(fā)光譜相重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光,同時供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。FRET程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)，一般小于10nm時即可發(fā)生FRETGFP的兩個突變體CFP（cyanfluorescentprotein）YFP（yellowfluorescentprotein）熒光共振能量轉(zhuǎn)移ThedistancebetweenactinmonomersinF-actinis55?,whichiswithinthetypicalrangeforFRET(10–100?).TaggingactinwithCFPandYFPasdonorandacceptor,respectively,allowsustouseFRETtoobservetheequilibriumbetweenF-actinandG-actininlivingcells.熒光共振能量轉(zhuǎn)移的應(yīng)用

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能分析核酸檢測細(xì)胞器結(jié)構(gòu)功能檢測等熒光漂白恢復(fù)技術(shù)P55

fluorescencerecoveryafterphotobleaching,FRAP借助高強(qiáng)度激光照射細(xì)胞某一區(qū)域，造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴(kuò)散，可通過低強(qiáng)度激光掃描探測此擴(kuò)散速率。

熒光漂白恢復(fù)技術(shù)

在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸、受體在細(xì)胞膜上的流動和大分子組裝等細(xì)胞生物學(xué)過程。

是檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，可用于檢測某一細(xì)胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。A)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)B)相差顯微鏡技術(shù)C)微分干涉顯微鏡技術(shù)D)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)√二、電子顯微鏡

（electronmicroscope）1932年德國學(xué)者M(jìn)axKnolls和ErnstRuska用波長比光短得多的電子作光源,發(fā)明了第一臺電子顯微鏡，大大提高了顯微鏡的分辨率（0.2nm），放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍，用于觀察超微結(jié)構(gòu)。電子束照明系統(tǒng)：主要由燈絲陰極和陽極組成。陰極電壓通常50~120KV，陽極為0V，兩極的電壓差異稱為加速電壓。電子束的波長與加速電壓的平方根成反比。成像系統(tǒng)：改變電子方向。真空系統(tǒng)：保持電鏡真空，防止空氣中分子會阻撓電子束的發(fā)射而不能成像。記錄系統(tǒng)：工作原理：電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出二級電子，由探測器收集，信號經(jīng)放大后在熒光屏上顯示出與電子束同步的掃描圖像。1透射電鏡（TransmissionelectronMicroscopeTEM）電子穿過樣本，觀察超薄切片2掃描電鏡（ScanningelectronMicroscopeSEM）用于觀察固體表面的形貌

電子顯微鏡分類1透射電鏡

超薄切片樣品制備超薄切片技術(shù)電鏡負(fù)染色技術(shù)冷凍蝕刻電鏡技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

電鏡技術(shù)超薄切片(uitrathinsection)電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。負(fù)染色(negativeStaining)和投影(shadowcasting)技術(shù)負(fù)染色:用重金屬鹽(如磷鎢酸鈉)對鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色,使整個載網(wǎng)都鋪上一層重金屬鹽,而凸出的樣品則沒有染料.投影技術(shù):又叫噴鍍技術(shù),是一種重要的增強(qiáng)背景和待觀察樣品反差的方法.冰凍蝕刻(freeze-etching)

冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)?？焖倮鋬錾疃任g刻技術(shù)(AYeastCell)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)掃描電鏡

掃描電鏡是用極細(xì)的電子束在樣品表面掃描，將產(chǎn)生的二次電子用特制的探測器收集，形成電信號運送到顯像管，在熒光屏上顯示細(xì)胞、組織表面的立體構(gòu)像。掃描電鏡

掃描電鏡照片展示注射針頭的掃描電鏡照片掃描電鏡照片展示不同倍率的果蠅掃描電鏡照片掃描電鏡照片展示可以用計算機(jī)將黑白照片處理成彩色掃描電鏡照片展示掃描電鏡照片展示肺細(xì)支氣管粘膜杯狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞掃描電鏡照片掃描電鏡照片展示掃描電鏡照片展示培養(yǎng)細(xì)胞掃描電鏡照片展示掃描電鏡透射電鏡三掃描隧道顯微鏡原理：根據(jù)量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)原理制成，可用于研究表面的原子結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)。特點：可對晶體或非晶體成像，分辨本領(lǐng)高；可實時得到樣品表面三維圖象；可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量；可連續(xù)成像，進(jìn)行動態(tài)觀察。用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。利用掃描隧道顯微鏡直接獲取細(xì)胞膜、細(xì)胞表面、病毒、生物大分子的結(jié)構(gòu)信息

realimage

可以利用()直接獲取細(xì)胞膜、細(xì)胞表面、病毒、生物大分子的結(jié)構(gòu)信息。A．掃描隧道顯微鏡B．掃描電鏡C．透射電鏡D．激光掃描共聚焦顯微鏡√第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

超高速離心分離技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)一、超高速離心分離技術(shù)用途：分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離差速離心

Differentialcentrifugation特點：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級離心。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體——核蛋白體?？蓪⒓?xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。

密度梯度離心

（densitygradientcentrifugation）

密度梯度離心是將要分離的組分放在已形成密度梯度的惰性物質(zhì)（如蔗糖）溶液的表面，在這種條件下進(jìn)行離心，不同組分以不同的沉降速度沉降，形成不同的沉降帶。

不同的細(xì)胞器、大分子和病毒的

密度及相應(yīng)的沉降系數(shù)

2.2密度梯度離心二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。FeulgenStainingmethodisspeicificforDNA(onionroottipcell)糖類顯示：PAS反應(yīng)最常用于顯示細(xì)胞、組織內(nèi)的多糖和蛋白多糖的方法是過碘酸-雪夫反應(yīng)（periodicacidSchiff，PAS反應(yīng))?；驹硎牵禾潜粡?qiáng)氧化劑過碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者與Schiff試劑中的無色品紅亞硫酸復(fù)合物結(jié)合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物，PAS反應(yīng)陽性部位即表示多糖的存在。

脂類顯示

標(biāo)本可用甲醛固定、冷凍切片、用油紅、蘇丹Ⅲ、蘇內(nèi)Ⅵ、蘇丹黑B、尼羅藍(lán)等脂溶性染料染色

AKP(堿性磷酸酶)染色Feulgen反應(yīng)是一種經(jīng)典的細(xì)胞化學(xué)染色方法，常用于細(xì)胞內(nèi)（）。A．蛋白質(zhì)的分布與定位B．脂肪的分布與定位C．DNA的分布與定位D．RNA的分布與定位

√三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)：

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限

免疫電鏡技術(shù)：

免疫鐵蛋白技術(shù)

免疫酶標(biāo)技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)

√

免疫熒光技術(shù):表面抗原與受體AdhesionReceptorsMetaboliccytokinesstructureenzymes抗原標(biāo)記抗體光原熒光直接免疫熒光法間接法原理示意圖抗原抗體1標(biāo)記抗體2光原熒光

間接免疫熒光法免疫膠體金技術(shù)原理

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸在還原劑作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金膠體金應(yīng)用膠體金應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)由于標(biāo)記物的制備簡便，方法敏感、特異，不需要使用放射性同位素，或有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物，也不要熒光顯微鏡，它的應(yīng)用范圍廣，除應(yīng)用于光鏡或電鏡的免疫組化外，更廣泛地應(yīng)用于各種液相免疫測定和固相免疫分析以及流式細(xì)胞術(shù)等。四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

核酸分子雜交按照堿基互補(bǔ)配對原則，將不同來源的序列互補(bǔ)單鏈的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互補(bǔ)配對成雙鏈雜交分子，這一過程叫核酸分子雜交常用核酸分子雜交技術(shù)①Southern印跡雜交；②Northern印跡雜交；③斑點雜交(dotblotting)；④原位雜交(insituhybridization)

Blotting：印跡\雜交SouthernBlotting:檢測特定DNA片斷NorthernBlotting:檢測RNAWesternBlotting:檢測蛋白質(zhì)斑點雜交將PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。

原位雜交

（insituhybridization)應(yīng)帶有標(biāo)記的（有放射性同位素、熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì))DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測核酸片段進(jìn)行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位；也可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。

熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片

合成

The

isatechniqueusedinmolecularbiologyresearchtostudygeneexpressionbydetectionofRNAinasample.

AsouthernblottingBwesternBlottingCnorthernBlottingDfluorescenceinsituhybridization√五、放射自顯影技術(shù)

原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動態(tài)和追蹤研究。

步驟：

標(biāo)記前體物摻入細(xì)胞

放射自顯影追蹤標(biāo)記物一般常用3H胸腺嘧啶脫氧核苷（3H-TdR）來顯示DNA用3H尿嘧啶核苷（3H-UdR）顯示RNA；用35S標(biāo)記的甲硫氨酸、半胱氨酸，3H或14C標(biāo)記的甲硫氨酸、亮氨酸研究蛋白質(zhì)用3H甘露糖、巖藻糖等研究多糖。

分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物的主要技術(shù)是（）A、超高速離心分離技術(shù)B、insituhybridizationC、層析技術(shù)D、WesternBlotting√六．定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)

細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（microspectrophotometry）

利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：1）紫外光顯微分光光度測定法2）可見光顯微分光光度測定法

流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）流式細(xì)胞術(shù)的基本原理

Flowcytometry流式細(xì)胞術(shù)的基本原理

FlowcytometryInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)

FlowcytometerLasersFluidicsComputersDetectorsLaserPowerSupplyBDVantageSEDiVaoption

BeckmanCoulterEpicsAltraHypersortDakoCytomationMoFloBDFACSAria+IncubateAcquire流式細(xì)胞術(shù)的基本原理

FlowcytometryLaserLight488nmFL2PESSCFSCFluidicsElectronicsComputerFL3PerCP,Cy5

FL1FITCFlowc