反-10,順-12cla對山羊乳脂合成抑制作用的影響

反-10,順-12cla對山羊乳脂合成抑制作用的影響

低脂肪率是指由日常食物因素引起的牛奶的低脂肪產(chǎn)量和脂肪量降低的。通常，高脂肪和低脂肪的日糧和補(bǔ)飼脂肪會導(dǎo)致低脂肪率的降低。在某些情況下，這種瓊脂率降低了50%。隨著我國奶牛業(yè)的快速發(fā)展,以質(zhì)論價已是原料奶收購中的普遍做法,乳脂降低問題引起了生產(chǎn)者和研究人員的普遍重視。當(dāng)前對MFD的解釋有瘤胃生物加氫飽和學(xué)說和葡萄糖-胰島素學(xué)說。瘤胃生物加氫飽和學(xué)說認(rèn)為,在特定日糧條件下瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變(主要是pH降低),導(dǎo)致多不飽和脂肪酸瘤胃生物加氫飽和代謝途徑發(fā)生變化,產(chǎn)生了對乳脂合成有強(qiáng)烈抑制作用的特殊類型的不飽和脂肪酸,從而使乳脂合成降低。最近一些研究工作為瘤胃加氫飽和學(xué)說提供了強(qiáng)有力的試驗證據(jù)[5,6,7,8,9,10,11,12,13]。葡萄糖-胰島素學(xué)說則認(rèn)為,在高精料/低粗料日糧條件下,瘤胃發(fā)酵的丙酸比例增加刺激胰島素分泌,改變了脂肪酸合成前體在體組織和乳腺組織之間的分配,從而抑制了乳脂的合成。瘤胃加氫飽和學(xué)說可以解釋奶牛日糧中添加不飽和脂肪酸(魚油、植物油等)及飼喂高精料日糧引起的MFD,前者是因為增加了反-10,順-12CLA合成的前體,后者則因為形成了有利于其合成的瘤胃內(nèi)環(huán)境。但給泌乳奶山羊補(bǔ)飼植物油、魚油的試驗未能引起乳脂率的下降,甚至乳脂率還有所升高,其原因既可能是奶山羊的乳脂合成不受反-10,順-12CLA的抑制,也可能是相關(guān)試驗中添加魚油或植物油雖然提高了瘤胃反-10,順-12CLA的產(chǎn)量,但仍未達(dá)到抑制乳脂合成的閾值劑量。本研究的目的是驗證反-10,順-12CLA對山羊乳脂合成是否有抑制作用及了解其機(jī)理,以期為MFD發(fā)生機(jī)制的闡明提供試驗證據(jù)。1材料和方法1.1試驗羊及日糧加工選用4只體況、胎次、年齡、產(chǎn)奶量和乳脂率相近的泌乳中期嶗山奶山羊,體質(zhì)量(45±5)kg。正式試驗前1個月給羊只做頸動脈游離手術(shù),并安裝永久性真胃瘺管。試驗日糧按AFRC設(shè)計,以干地瓜秧為主要粗飼料,與精料混合加工成顆粒料。每只試羊日喂量1.7kg,可滿足體質(zhì)量45kg、日產(chǎn)奶量1kg、乳脂率3.5%、乳蛋白率3.5%試羊的營養(yǎng)需要(表1)。1.2樣品采集和測定采用4×4拉丁方設(shè)計,4個試驗處理為真胃灌注0、2、4和8g·d-1共軛亞油酸(CLA)乳液(青島奧海生物有限公司,成分見表2),灌注劑量確定參考Chouinard等,各組灌注的CLA中分別含有0、0.784、1.568和3.136g·d-1的反-10,順-12CLA。每天灌注的CLA用脫脂乳乳化,配制成250mL的乳液,間隔4.8h分5次注入真胃,每次灌注量每期試驗7d,預(yù)灌注期為4d,采樣期3d,2期試驗之間間隔10d。每天按飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼喂羊只1.7kg左右飼料,自動喂料器每2h飼喂1次,自由飲水,每天記錄進(jìn)食量。日擠奶2次,分別在06:00和18:00各1次。奶樣按比例混合取樣。一份加入防腐劑4℃保存,用于乳成分測定;另一份不加防腐劑-20℃保存,用于乳脂脂肪酸測定。取乳樣提取粗脂肪,經(jīng)酸堿甲酯化處理后用色譜純正己烷提取脂肪酸,氣相色譜法測定乳脂脂肪酸含量。試驗期第3天早上擠奶后開始灌注馬尿酸(PAH),在灌注的1、1.5、2.0和2.5h時分4次同時采集頸動脈和乳靜脈血樣約10mL置于肝素鈉抗凝試管中,離心(3000r·min-1,15min)取血漿后于低溫保存頸動脈和乳靜脈血漿均測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、NEFA、甘油三酰(TG)和PAH含量,頸動脈血漿測定胰島素、血糖含量。氣象色譜法測定脫蛋白血漿VFA含量,試劑盒法測定NEFA、TG含量(南京建成生物工程研究所),放免測定胰島素含量(試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所,GC-911型10管放射免疫γ計數(shù)器),酶反應(yīng)法(美國強(qiáng)生血糖測定儀)測定血糖含量,PAH測定參照Katz等的方法。每期試驗的第8天早上擠奶后4～5h活體采集取對照組和8g·d-1CLA灌注組試羊乳腺組織樣品。取樣前約15min在取樣部位環(huán)形注射鹽酸普魯卡因,于右側(cè)乳房正中做2～3cm皮膚切口,鈍性剝離結(jié)締組織,暴露乳腺組織。取約200mg乳腺組織立即在液氮中冷凍并在-80℃保存。羊腸線縫合腺體和結(jié)締組織,手術(shù)縫合線結(jié)節(jié)縫合皮膚。活體組織取樣后2h內(nèi)擠奶1次。為預(yù)防試羊感染,乳腺組織采樣后連續(xù)4d肌肉注射青霉素(320萬單位·天-1)和鏈霉素(40萬單位·天-1)。實時熒光定量PCR法測定乳腺組織乙酰CoA羧化酶(ACC)mRNA表達(dá)量,以β-actin為參照基因,倍比稀釋法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)時,每個樣品的參照和目的基因均在同一反應(yīng)板上進(jìn)行擴(kuò)增,使用相同的優(yōu)化擴(kuò)增程序,以最大限度地保證參照和目的基因具有相同的擴(kuò)增效率將相同試羊接受對照處理時的目的基因表達(dá)量設(shè)為1,按下式計算其接受8g·d-1CLA灌注時目的基因的表達(dá)量:式中ΔΔCT=ΔCT,T-ΔCT,R,A是標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,ΔCT,T和ΔCT,R分別是目的和參照基因試驗組與對照組熒光閾值循環(huán)數(shù)CT值之差。1.3durcan氏新復(fù)教實驗結(jié)果利用SAS軟件的一般線性模型(Generalinearmodels)進(jìn)行方差分析,統(tǒng)計分析模型為:其中:Yijkl=各觀察值;μ=總平均值;Ti=處理效應(yīng);Sj=試驗期效應(yīng)(j=1、2、3和4);Gk=奶山羊個體效應(yīng);Dl=采樣天數(shù)效應(yīng);eijkl=隨機(jī)誤差。用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。P≤0.01為差異極顯著,P≤0.05為差異顯著,0.05<P<0.10為有差異趨勢。2結(jié)果2.1cla灌注對乳蛋白和snf的影響由表3可知,真胃灌注CLA對產(chǎn)奶量沒有顯著影響(P>0.1);灌注CLA>4g·d-1時極顯著降低了乳脂率、乳脂產(chǎn)量(P<0.01),提高了乳蛋白率(P<0.01),但乳蛋白產(chǎn)量變化不明顯;對乳糖含量、乳糖產(chǎn)量和SNF產(chǎn)量沒有顯著影響(P>0.1)。多重比較結(jié)果表明,2g·d-1CLA灌注組的乳脂含量和產(chǎn)量與對照組差異不顯著(P>0.1),4和8g·d-1CLA灌注組的乳脂含量和產(chǎn)量極顯著低于對照組和2g·d-1CLA灌注組(P<0.01)。CLA灌注提高了乳蛋白率(P<0.01)?；貧w分析表明,乳脂率隨CLA灌注量線性降低,回歸公式為:y=-0.1972x+3.7918(R2=0.70,P<0.01)。試驗期內(nèi)試羊體質(zhì)量無顯著變化(數(shù)據(jù)未列出),無剩料現(xiàn)象。2.2血液乙酸乙酯tg、4-f、3-丁酸、tg、丙酸、丁酸、丁酸、丁酸由表4可知,真胃CLA灌注降低了乳腺對血液非酯化脂肪酸(NEFA)提取率(P<0.05),對血液乙酸提取率有先上升后下降的趨勢(P<0.1),對乳腺血漿流量(MPF)沒有顯著影響(P>0.1),對動脈甘油三酯(TG)、NEFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度及其乳腺提取量和TG、丙酸、丁酸的乳腺提取率沒有顯著影響(P>0.1)。2.3真胃灌注cla對乳脂脂肪酸的影響乳脂脂肪酸構(gòu)成見表5。乳脂中<C16的中短鏈脂肪酸是在乳腺中從頭合成的,其含量或者隨著CLA灌注量的升高而降低,或者保持不變,其中含量降低的脂肪酸有C8:0和C14:1(P<0.05)。乳脂中C16的脂肪酸或者來自乳腺從頭合成,或者直接自血液吸收,在測定的2種C16脂肪酸中,CLA真胃灌注提高了C16:0的含量,但降低了C16:1的含量(P<0.05)。由于乳脂中C16:1的含量遠(yuǎn)低于C16:0,因此2種脂肪酸的總含量顯著上升(P<0.05)。對>C16的脂肪酸,CLA真胃灌注或者沒有明顯改變其在乳脂中的含量或者提高了其在乳脂中的含量(P<0.05)。唯一例外是CLA灌注降低了乳脂中c9C18:1的含量(P<0.05)。乳腺組織中的-脫飽和酶可以對脂肪酸脫飽和,C14:0/C14:1、C16:0/C16:1、C18:0/c9C18:1和t11C18:1/c9t11CLA是該酶的底物與對應(yīng)產(chǎn)物。對乳脂中4對脂肪酸的比例分析表明,CLA真胃灌注除未改變C18:0/c9C18:1的比例外,其它3對脂肪酸的比例均顯著升高(P<0.05)。乳脂脂肪酸構(gòu)成總的變化是,真胃CLA灌注未顯著改變?nèi)橹袕念^合成和血液吸收脂肪酸的含量,僅C16+C16:1脂肪酸的含量升高。而-脫飽和酶底物脂肪酸含量與對應(yīng)產(chǎn)物脂肪酸含量比值的升高則說明該酶的活性降低。對乳腺從頭合成脂肪(C4-C14:1)的含量和血液吸收脂肪酸(>C16)的含量無顯著影響。隨CLA添加量的升高,乳脂脂肪酸中c9,t11CLA(P<0.01)、t10,c12CLA(P<0.05)、c9,c11CLA(P<0.05)和t9,t11CLA(P<0.01)的含量逐漸升高。乳脂脂肪酸的產(chǎn)量見表6。除C18:0、c9,t11CLA和t10,c12CLA等3種脂肪酸產(chǎn)量外,CLA真胃灌注或者沒有影響其它脂肪酸的產(chǎn)量(P>0.1)或者使脂肪酸的產(chǎn)量降低(P<0.05)。c9,t11CLA和t10,c12CLA是灌注CLA產(chǎn)品中含量最大的2種脂肪酸,其產(chǎn)量隨CLA灌注量的增加而增加。每天灌注2gCLA的C18:0產(chǎn)量顯著高于對照組(P<0.05),進(jìn)一步將CLA的日灌注量提高到4和8g則又使C18:0的產(chǎn)量降低,且8g灌注組顯著低于2g灌注組(P<0.05)。CLA日灌注量為2g時未降低乳脂率和乳脂產(chǎn)量(表3),而灌注的產(chǎn)品主要是的脂肪酸其中除含有C18:0脂肪酸外,其它不飽和的C18脂肪酸在瘤胃中經(jīng)加氫飽和可以轉(zhuǎn)變?yōu)轱柡虲18:0脂肪酸。因此,2g·d-1CLA灌注組C18:0脂肪酸產(chǎn)量升高的原因是該脂肪酸供給量增加的結(jié)果,而進(jìn)一步提高CLA的灌注量降低了該脂肪酸的產(chǎn)量則是乳脂合成受到抑制的結(jié)果。真胃灌注CLA降低了C14:1、C16:1和>C16脂肪酸的產(chǎn)量(P<0.05),對C16:0脂肪酸的產(chǎn)量沒有影響,但表觀值隨CLA灌注量的增加而降低(P=0.19)。與對照組比較,8g·d-1CLA灌注組的C4-C14:1、C16+C16:1和>C16脂肪酸的產(chǎn)量分別下降了42.68%、36.15%和2.4基于倍比的司法測定對每份乳腺組織樣品提取的總RNA均進(jìn)行凝膠電泳分析,用GeneTool軟件分析28S和18S帶的比值,并測定總RNA在260和280nm吸光度的比值,提取總RNA符合1.5和吸光度比值在1.8～2.0之間的條件可用于后續(xù)試驗(圖略)。倍比稀釋法測定得到以下標(biāo)準(zhǔn)曲線其中X是初始拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)。由表7,以對照組ACC基因mRNA的表達(dá)量為1,相同試羊在接受8g·d-1CLA灌注后ACC基因mRNA的表達(dá)指數(shù)(F值)在0.042～0.067之間,即表達(dá)量是對照組的4.2%～6.7%,平均為對照組的4.7%,因而CLA灌注對ACC基因的表達(dá)有明顯的抑制作用3真胃灌注抑制乳脂合成的活性研究結(jié)果表明灌注降低了泌乳山羊的乳脂率和乳脂產(chǎn)量,乳蛋白率顯著升高,乳蛋白產(chǎn)量有升高的趨勢。乳脂合成需要消耗能量,有研究表明,乳脂合成消耗的能量占乳生成過程消耗總能量的50%以上。因而CLA灌注因抑制乳脂合成減少的部分能量消耗有可能被分配到乳蛋白的合成過程中,從而提高了乳蛋白的產(chǎn)量?？赡艿臋C(jī)制是乳腺脂肪酸的從頭合成消耗葡萄糖,乳腺脂肪酸合成減少對葡萄糖的需要量降低,這會進(jìn)一步減少用于糖異生的生糖氨基酸消耗。Erasmus等給奶山羊口服3.9g·d-1CLA(含有0.69g反-10,順-12CLA)未能引起奶山羊乳脂率的下降。Baumgard等每天給泌乳奶牛真胃灌注3.5g反-10,順-12CLA使乳脂產(chǎn)量下降了25%。本試驗使用的CLA產(chǎn)品含有31.6%反-10,順-12CLA的CLA,每天2、4、8g的灌注量分別相當(dāng)于向真胃中關(guān)注了0.63、1.26和2.52g反-10,順-12CLA。2g·d-1CLA灌注組未引起乳脂率和乳脂產(chǎn)量的下降,4和8g·d-1灌注組的乳脂率分別下降了15.1%和41.2%,乳脂產(chǎn)量分別下降了18.2%和45.2%。由本試驗結(jié)果,奶山羊每天瘤胃后灌注1.26g(有效含量)反-10,順-12CLA即可抑制乳脂的合成,低于奶牛3.5g的抑制劑量。但山羊的體質(zhì)量遠(yuǎn)低于奶牛(本試驗為(45±5)kg),按單位體質(zhì)量計算的抑制劑量較高。對乳脂脂肪酸構(gòu)成和乳脂脂肪酸產(chǎn)量的分析表明,反-10,順-12CLA既降低了從頭合成脂肪酸的產(chǎn)量,也降低了乳腺自血液吸收脂肪酸的產(chǎn)量。類似的變化在奶牛和綿羊的研究中也有報道。從乳脂脂肪酸構(gòu)成變化看,<C16的脂肪酸比例或者不變,或者顯著降低;>C16脂肪酸的比例或者不變,或者顯著升高;C16:0脂肪酸的比例則顯著升高。由于總的<C16脂肪酸和總的>C16脂肪酸比例沒有明顯變化,反-10,順-12CLA對乳腺脂肪酸的從頭合成和乳腺用血液吸收脂肪酸合成乳脂的抑制強(qiáng)度近似。而<C16脂肪酸中C8:0的比例顯著降低、C16:0的比例顯著升高則意味著反-10,順-12CLA在抑制乳腺從頭合成脂肪酸的同時,對于從頭合成脂肪酸碳鏈的延長有促進(jìn)作用。乳脂中C14:0/C14:1、C16:0/C16:1、C18:0/c9C18:1和t11C18:1/c9,t11CLA4對脂肪酸是乳腺-脫飽和酶對應(yīng)的底物和產(chǎn)物,CLA灌注除未引起C18:0/c9C18:1比值的顯著變化外,其它3對脂肪酸的比值均升高,說明在本試驗條件下乳腺-脫飽和酶的活性降低。試驗觀察到,CLA真胃灌注強(qiáng)烈抑制乳腺從頭合成脂肪酸關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶的表達(dá)水平該酶催化脂肪酸從頭合成的第一步反應(yīng),其mRNA表達(dá)活性的降低與觀察到