奶牛流產(chǎn)布氏桿菌的分離鑒定

奶牛流產(chǎn)布氏桿菌的分離鑒定

布氏桿菌病是一種在世界上流行的人類疾病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動物疫病,我國將其列為二類動物疫病。自1895年Marston等首次報道布氏桿菌病以來,已經(jīng)確定的布氏桿菌有6個種屬20個生物型,牛布氏菌病是引起牛流產(chǎn)的主要病因之一,以流產(chǎn)布氏桿菌(Brucellaabortus)感染最常見,以母畜發(fā)生流產(chǎn)和不孕,隨子宮排泄物和乳汁排出病原菌,公畜發(fā)生睪丸炎和不育為主要患病特征。2005年1～5月,黑龍江省大慶市2個牛場(DC1和DC2)、五常市1個牛場(DC3)和伊春市1個牛場的奶牛頻繁發(fā)生流產(chǎn)。為弄清病因,對4個牛場進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,同時采集病料,通過病原分離鑒定、血清學(xué)診斷和PCR鑒定確定引起奶牛流產(chǎn)的主要病原菌,為牛場布氏桿菌病的預(yù)防和控制提供依據(jù)。1材料和方法1材料表面1.1疾病宣言1.2培養(yǎng)基和試劑2方法2.1培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)將流產(chǎn)胎牛真胃內(nèi)容物,肝臟和脾臟等病料分別接種于10%的新鮮綿羊血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,分別做普通需氧、微需氧和厭氧(燭缸法)培養(yǎng),37℃培養(yǎng)3～5d后觀察菌落形態(tài)和有無溶血情況,并進(jìn)行革蘭染色、沙黃孔雀綠和改良Ziehl-Neelsen染色鑒定。2.3細(xì)菌的生化特性2.4菌株和引物布氏桿菌IS711(插入序列)在數(shù)量和位置上都很保守,所有的種在單染色體上都含有至少1個拷貝的IS711。根據(jù)布氏桿菌不同種IS711的不同設(shè)計4條引物,分別用于鑒別流產(chǎn)布氏桿菌、豬布氏桿菌(B.suis)和羊布氏桿菌(B.ovis)。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。P1:5/-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′;P2:5/-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′;P3:5/-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3′;P4:5/-CGGGTTCTGGCACCATCGTCG-3′。P1和P2用于鑒定流產(chǎn)布氏桿菌,擴(kuò)增產(chǎn)物為498bp;P1和P3用于鑒定豬布氏桿菌,擴(kuò)增產(chǎn)物為285bp;P1和P4用于鑒定羊布氏桿菌,擴(kuò)增產(chǎn)物為976bp。2.4.2pcr和凝膠電泳采用25μl反應(yīng)體系:引物濃度均為0.5μmol/L,dNTP濃度200μmol/L,LATaqDNA聚合酶1.25U,PCR緩沖溶液(100mmol/LTris-HCl,pH8.3,50mmol/LKCl,0.1%BSA,20mmol/LMgCl2),DNA模版1μl,補(bǔ)充去離子水至總體積為25μl。反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性10min;94℃變性50s,61.1℃退火1min,72℃延伸50s,共30個循環(huán);72℃延伸10min。取8μlPCR產(chǎn)物,用1%的瓊脂糖凝膠在0.15×TBE電泳液(0.045mol/LTris-硼酸,0.001mol/LEDTA,pH8.0)中電泳,EB染色,利用凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc2000)觀察擴(kuò)增結(jié)果。4個牛場送檢75份流產(chǎn)奶牛血清。采用國標(biāo)GB/T18646-2002動物布氏桿菌病診斷技術(shù)檢測布氏桿菌抗體。同時采用衣原體間接血凝試驗(IHA)檢測上述血清,按試劑盒使用說明操作。送檢血清中DC110份,DC215份,DC320份,DC430份。結(jié)果1年生反壓h4個牛場奶牛流產(chǎn)發(fā)生情況見表1。奶牛流產(chǎn)發(fā)生率為9.5%(102/1100),流產(chǎn)發(fā)生在妊娠期1～4周、5～7周和8周至產(chǎn)前者分別占9.8%(10/102)、68.6%(70/102)和21.6%(22/102)。2病牛有蓮子內(nèi)皮炎病牛流產(chǎn)前數(shù)天開始從陰門流出淡黃色惡臭液體;流產(chǎn)后多數(shù)病牛有子宮內(nèi)膜炎,人工授精比較困難;胎衣不下,呈淡黃色膠凍樣浸潤,可見纖維蛋白絮狀物和膿性分泌物。3胎盤牛檢查流產(chǎn)胎牛多數(shù)皮下膠胨樣水腫,腹腔積液,肝臟腫大,脾臟稍腫大且質(zhì)軟,腎臟膠胨樣水腫。未發(fā)現(xiàn)畸胎。4細(xì)菌的分離和鑒定4.1培養(yǎng)基細(xì)菌生長和生物量病料接種培養(yǎng)基,需氧條件下培養(yǎng)3d未見細(xì)菌生長,培養(yǎng)1周觀察仍未見細(xì)菌生長。厭氧培養(yǎng)和微需氧培養(yǎng)至第4d,接種真胃內(nèi)容物的血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均有細(xì)菌生長,菌落中等大小,圓形隆起,表面光滑、濕潤,有光澤,無色透明,側(cè)光觀察呈輕微乳色和略帶藍(lán)灰色,不溶血,不易溶于生理鹽水。2份流產(chǎn)胎牛的肝臟和脾臟材料經(jīng)上述方法培養(yǎng)有相同細(xì)菌生長。4.2紅色菌體的檢測取菌落涂片,革蘭染色和改良Ziehl-Neelsen染色后菌體均呈紅色;沙黃孔雀綠染色呈藍(lán)色或綠色,細(xì)菌呈球桿狀或小桿狀,多單個散在,無芽孢和莢膜。4.3生物化學(xué)試驗的結(jié)果分離的生化試驗結(jié)果見表2。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》確定各分離株生化指標(biāo)符合布氏桿菌的主要特征。5擴(kuò)增pcr擴(kuò)增分離到的6株細(xì)菌用P1和P2引物作PCR,均擴(kuò)增出約498bp的片段,P1與P3和P1與P4兩對引物均未擴(kuò)增出目的片段(圖1)。6株布氏桿菌均為流產(chǎn)布氏桿菌。6凝集試驗結(jié)果4個牛場送檢血樣104份,布氏桿菌試管凝集試驗陽性85份,陽性率81.7%,另有11份為疑似陽性(表3)。衣原體IHA檢測75份血樣,結(jié)果均為陰性。黨牛和外在血藥病人的感染和傳氏桿菌病根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀、病理剖檢情況及微生物學(xué)和血清學(xué)診斷,確診4個牛場奶牛流產(chǎn)主要由布氏桿菌引起。通過PCR方法擴(kuò)增布氏桿菌插入子序列IS711,進(jìn)一步鑒定分離出的6株布氏桿菌均為流產(chǎn)布氏桿菌。布氏桿菌是需氧菌,在有氧條件下生長良好,但是流產(chǎn)布氏桿菌1～4型多數(shù)必須有CO2的條件才能生長。本次實驗中分離到的流產(chǎn)布氏桿菌只能在5%O2、10%CO2和85%N2的微需氧環(huán)境中生長,在有氧條件下1周未見其生長,符合該菌的培養(yǎng)特性。通過流行病學(xué)調(diào)查及臨床癥狀分析發(fā)現(xiàn),感染布氏桿菌奶牛容易在妊娠后5～8個月間發(fā)生流產(chǎn),剖檢流產(chǎn)胎牛普遍表現(xiàn)皮下水腫特別是臍帶水腫,腹腔和膝關(guān)節(jié)腔積液,肝臟腫大,腎臟膠凍樣水腫,但未見胎牛畸形,可供臨床診斷。引起奶牛流產(chǎn)的原因比較復(fù)雜,傳染和非傳染性因素都可能引起流產(chǎn)。傳染性原因包括細(xì)菌、霉菌、病毒和原蟲感染,其幾率分別為50%～65%、20%～25%和15%～25%。奶牛細(xì)菌性流產(chǎn)的病原以布氏桿菌較多見。朱戰(zhàn)波等在暴發(fā)奶牛流產(chǎn)的牛場,從流產(chǎn)胎牛體內(nèi)分離到流產(chǎn)胎兒彎曲菌,可見由胎兒彎曲桿菌引起的牛流產(chǎn)也不容忽視。非傳染性的因素包括營養(yǎng)狀況,化學(xué)物質(zhì)、藥物、毒素、有毒植物和激素等。各地的氣候、飼養(yǎng)管理條件等情況不同,流產(chǎn)的發(fā)生率也不同。本次試驗中,104頭流產(chǎn)牛血清衣原體IHA陰性,也未檢測到彎曲菌,說明本地區(qū)可能不存在牛衣原體病,布氏桿菌病是造成本地奶牛流產(chǎn)的主要病因。布氏桿菌有高度的侵襲力和擴(kuò)散力,可以通過正常的皮膚、黏膜侵入機(jī)體,也可通過呼吸道、消化道和生殖道傳染。目前對布氏桿菌病仍無有效的治療藥物,主要以預(yù)防為主。由于該病臨床上多呈隱性經(jīng)過,又缺乏典型癥狀,極易被忽視。因此奶牛場要堅持每年進(jìn)行兩次布氏菌病血清學(xué)檢測,對平板凝集試驗陽性和可疑者要進(jìn)一步進(jìn)行試管凝集試驗和補(bǔ)體結(jié)合試驗,確診的病牛必須及時予以淘汰,同群健康牛進(jìn)行免疫接種,防止布氏桿菌病流行。流產(chǎn)母牛血清,流產(chǎn)胎牛的第四胃內(nèi)容物,肝、脾和羊水等(無菌采集)。10%血液瓊脂培養(yǎng)基,按常規(guī)方法制備。生化管購自杭州天和微生物有限公司(批號:20041220);LATaqDNA聚合酶、dNTP和Marker購自寶生物工程(大連)有限公司。布氏桿菌試管凝集抗原、陽性血清和陰性血清,購自黑龍江省生物制品一廠(批號:20050103);衣原體試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所(批號:20040512)。對4個牛