細(xì)胞水平的高通量篩選技術(shù)研究進(jìn)展

細(xì)胞水平的高通量篩選技術(shù)研究進(jìn)展

隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，特別是功能誘導(dǎo)、蛋白質(zhì)組、代謝組、細(xì)胞組、組合化學(xué)和聯(lián)合生物合成等新領(lǐng)域的啟動(dòng)，潛在藥物作用的目標(biāo)數(shù)量和所需活性物質(zhì)的數(shù)量顯著增加。這些進(jìn)展為高通量藥物篩選提供了良好的條件,同時(shí)也對(duì)高通量篩選的效率提出了更高的要求,不僅需要更大的篩選規(guī)模和篩選速度,同時(shí)也要求篩選模型的檢測技術(shù)能夠更快速、全面反映被篩樣品的生物活性特征。細(xì)胞水平的高通量篩選比分子水平的篩選更能適應(yīng)以上需要。標(biāo)準(zhǔn)的體外分子水平篩選技術(shù)具有快速、微量的特點(diǎn),篩選結(jié)果準(zhǔn)確,穩(wěn)定,易于評(píng)價(jià),但其檢測模型只能做到對(duì)特定靶點(diǎn)的單指標(biāo)檢測,提供化合物對(duì)靶點(diǎn)作用的有限信息,無法對(duì)化合物的生物活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。因此,單純的分子水平的高通量藥物篩選技術(shù)已不能滿足新藥發(fā)現(xiàn)的需要。而細(xì)胞水平篩選涉及完整細(xì)胞,其在活細(xì)胞自然條件下研究藥物對(duì)生命體功能的影響,接近體內(nèi)的生化過程,可以比較準(zhǔn)確地了解藥物的生物學(xué)特性,提供生物相關(guān)信息,并可通過一次試驗(yàn)獲得多個(gè)參數(shù)的高內(nèi)涵信息。筆者主要就目前細(xì)胞水平的高通量篩選技術(shù)進(jìn)展情況作一介紹。1細(xì)胞水平高通量篩選技術(shù)目前這方面的進(jìn)展有如下幾個(gè)方面:①微量化,超高通量化:到2000年止,國外大多數(shù)的制藥公司細(xì)胞水平的篩選已經(jīng)至少達(dá)到了1536孔板的規(guī)模。尤其是對(duì)于熒光方法,目前有報(bào)道可以達(dá)到3456甚至9600孔。應(yīng)該說微量化技術(shù)是實(shí)行超高通量篩選(uHTS)的基礎(chǔ)。但隨著檢測體積的減少,對(duì)載體微孔板硬度和加樣自動(dòng)化精度要求越來越高,同時(shí)對(duì)檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)也提出了更高要求。②均質(zhì)檢測:所謂均質(zhì)檢測是指采用一步加入策略,盡可能省去過濾,離心和沖洗等繁瑣的難于自動(dòng)化的步驟。③多指標(biāo)、多靶點(diǎn),多通道檢測:多指標(biāo),多靶點(diǎn),多通道是現(xiàn)今細(xì)胞水平高通量篩選技術(shù)的核心和關(guān)鍵。而光顯微熒光成像技術(shù)是進(jìn)行多指標(biāo)檢測的基礎(chǔ)。通過多指標(biāo)、多靶點(diǎn)檢測有助于發(fā)現(xiàn)藥物作用的新途徑,深入認(rèn)識(shí)藥物作用的機(jī)制。另外也為篩選具有互補(bǔ)的多靶點(diǎn)作用機(jī)制的單一治療藥物提供了手段和工具。④實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測和可視化:通過對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記,利用先進(jìn)的熒光成像技術(shù),可實(shí)現(xiàn)對(duì)研究對(duì)象的分子水平的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測和可視化研究,并可進(jìn)行自動(dòng)圖像分析和數(shù)據(jù)量化分析。2流場細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞水平篩選體系常用技術(shù)包括分子克隆和表達(dá),報(bào)告基因系統(tǒng),熒光標(biāo)記檢測,離子流檢測,熒光影像技術(shù)和微量化技術(shù),這些相關(guān)技術(shù)系統(tǒng)的快速發(fā)展無疑推動(dòng)了細(xì)胞水平篩選技術(shù)的發(fā)展。到目前為止,靶向細(xì)胞因子、生長因子、離子通道和G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)在細(xì)胞水平上的功能性檢測中都取得了成功的進(jìn)展。2.1以整合性的基因?yàn)橐劳?不通過重組基因的定位重組技術(shù)是細(xì)胞水平高通量常用技術(shù)手段,經(jīng)典的方法是通過重組基因在宿主細(xì)胞基因組的隨機(jī)整合而產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞株。這種重組技術(shù)的不足之處在于重組基因的定位不可預(yù)測,表達(dá)水平受重組位點(diǎn)的影響,基因拷貝數(shù)不確定,陽性克隆的產(chǎn)生率低,篩選時(shí)間長等。而采用游離體載體(episomalvector)克服了上述不足,轉(zhuǎn)染效率高,陽性克隆篩選速度快。2.2gfp及其受體基因檢測該技術(shù)是將靶基因連接到細(xì)胞上,通過激活或抑制靶基因?qū)е聢?bào)告基因的表達(dá),再通過比色、熒光或發(fā)光的方法進(jìn)行檢測。目前報(bào)告基因技術(shù)應(yīng)用更加簡便,如熒光素酶(luciferase)和β-半乳糖苷酶報(bào)告基因系統(tǒng),不需裂解分離可直接均質(zhì)檢測。目前活體細(xì)胞應(yīng)用較多的報(bào)告基因是綠色熒光蛋白(GFP),因其適于活體細(xì)胞檢測,被稱為生物傳感蛋白。它的優(yōu)點(diǎn)是具有自發(fā)熒光,不需其他的底物和輔因子且熒光穩(wěn)定,另外GFP與其他蛋白嵌合后不影響其自身熒光特性。GFP及其變體作為報(bào)告基因適用于實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究體內(nèi)或細(xì)胞水平的蛋白定位和轉(zhuǎn)位,蛋白的降解,蛋白-蛋白的相互作用,細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué),細(xì)胞周期,并可檢測目的基因表達(dá)變化。目前常用的報(bào)告基因還有β-內(nèi)酰胺酶,文獻(xiàn)報(bào)道通過其水解熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)底物CCF4/AM來進(jìn)行定量檢測,或作為核因子調(diào)節(jié)的指示蛋白,常用于受體功能篩選。2.3熒光特性的提高在細(xì)胞篩選中使用熒光技術(shù),不僅可定量讀取熒光密度,還可在單次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)獲得其他的熒光特性,如熒光壽命,極化,淬滅,提高篩選的有效性,可快速、多參數(shù)的評(píng)價(jià)樣品和靶之間的相互作用。2.3.1熒光標(biāo)記物法fpFP是分析生物體系中分子間相互作用的一種技術(shù),它可以根據(jù)熒光標(biāo)記的小分子在游離和與大結(jié)合分子靶標(biāo)2種狀態(tài)時(shí)的極化熒光值不同而加以區(qū)分。FP的最大優(yōu)點(diǎn)是不用分離游離的熒光標(biāo)記物,整個(gè)反應(yīng)在均相溶液中進(jìn)行,且檢測時(shí)間不會(huì)影響結(jié)果,具有高靈敏性、高穩(wěn)定性和可重復(fù)性的特點(diǎn)。該方法操作簡便,假陰性或假陽性率低,是一種理想的研究方法,可用于細(xì)胞水平的膜受體如GPCR、核受體調(diào)節(jié)劑的HTS篩選。有報(bào)道Linda等采用該方法用于促腎上腺皮質(zhì)激素2α亞型受體(CRF2αR)的功能分析中cAMP的直接檢測。2.3.2熒光底物fretFRET是指非放射性能量在適當(dāng)能量給予體和接受體之間轉(zhuǎn)移。當(dāng)給體激發(fā)態(tài)能量滿足光學(xué)和空間上的要求時(shí),其能量能有效轉(zhuǎn)移給受體,導(dǎo)致受體發(fā)射熒光。而隨著給體和受體空間距離的變化能顯著影響能量的有效轉(zhuǎn)移效率,利用這一原理可進(jìn)行熒光底物設(shè)計(jì)和人工合成,并用于分子間相互作用分析。目前細(xì)胞篩選常用的β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)報(bào)告基因檢測系統(tǒng)采用的熒光底物就是基于FRET的原理,化學(xué)合成底物CCF4,為一分子頭孢菌素聯(lián)上一分子7-羥基香豆素和一分子熒光素(fluorescein)。當(dāng)體系無配基激活時(shí),底物完整,激發(fā)香豆素導(dǎo)致發(fā)射530nm綠光,如加入研究受體的特異性配基,報(bào)告基因系統(tǒng)激活,表達(dá)β-lactamase,底物被β-lactamase裂解,破壞了FRET,激發(fā)香豆素發(fā)射460nm藍(lán)光。如有文獻(xiàn)報(bào)道將其用于GPCR受體-催產(chǎn)素受體(hOTR)的篩選。另有文獻(xiàn)報(bào)道采用FRET原理設(shè)計(jì)淬滅型底物進(jìn)行激酶的篩選。2.3.3受體分離和相助-配體相分離TREF是一種雙標(biāo)記方法,其原理是在長壽熒光鑭系復(fù)合物和共振能量受體之間的長范圍能量傳遞。TREF是在液態(tài)條件下進(jìn)行的,不需固定相支持和分離步驟,也不需對(duì)試劑進(jìn)行特殊處理。其優(yōu)點(diǎn)是通過減少背景,使長期存在的供體和受體信號(hào)隨時(shí)間顯示很高的敏感性。目前廣泛用于蛋白與蛋白結(jié)合分析、受體配體結(jié)合分析等。Hugo等利用長壽熒光金屬銪作供體成分,用另一個(gè)熒光分子XL665(一個(gè)改型別藻藍(lán)蛋白的片斷)作為受體進(jìn)行了β-分泌酶抑制劑的細(xì)胞水平篩選。2.4熒光相關(guān)成像檢測細(xì)胞系統(tǒng)的優(yōu)勢涵蓋高內(nèi)涵篩選技術(shù)、共聚焦顯微成像技術(shù)、熒光相關(guān)光譜技術(shù)等。2.4.1高內(nèi)涵篩選(highcontentscreening,HCS)所謂高內(nèi)涵篩選是指在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下,同時(shí)檢測被篩樣品對(duì)活細(xì)胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各個(gè)環(huán)節(jié)的影響,最大特點(diǎn)是可在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量相關(guān)信息,確定樣品生物活性和潛在毒性。高內(nèi)涵篩選是一種應(yīng)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng),在細(xì)胞水平上檢測多個(gè)指標(biāo)的多元化、功能性篩選技術(shù),旨在獲得被篩樣品對(duì)固定化或動(dòng)態(tài)細(xì)胞產(chǎn)生的多維立體和實(shí)時(shí)快速的生物效應(yīng)信息。高內(nèi)涵篩選技術(shù)的檢測范圍包括:靶點(diǎn)激活、細(xì)胞分裂及凋亡、蛋白轉(zhuǎn)位、細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移、受體內(nèi)化、細(xì)胞毒性、細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),還可用來監(jiān)測細(xì)胞器、活性物質(zhì)釋放(一氧化氮、活性氧、胞內(nèi)鈣離子)等。目前,HCS技術(shù)被廣泛應(yīng)用于藥靶的證實(shí)和藥物初篩,尤其適用于諸如GPCR功能性研究,藥物多靶點(diǎn)研究,癌癥的綜合研究,多指標(biāo)形態(tài)學(xué)觀察,激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究等。Gurwitz等采用HCS對(duì)細(xì)胞水平的17種蛋白同時(shí)進(jìn)行了檢測。其中,CellCardTM系統(tǒng)是一種新的多通道(multiplexed)HCS篩選技術(shù),由VitraBioscience公司開發(fā),可在96孔板單孔中實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)細(xì)胞系或多靶點(diǎn)的同時(shí)檢測,是一種基于多通道的全自動(dòng)影像系統(tǒng)。該系統(tǒng)可在單一檢測中應(yīng)用多參數(shù)檢測,可定量單一細(xì)胞類型中多個(gè)細(xì)胞內(nèi)事件或?qū)Χ鄠€(gè)細(xì)胞類型實(shí)行同一檢測,在獲得樣品活性的同時(shí)得到樣品對(duì)不同細(xì)胞株上設(shè)計(jì)的不同靶點(diǎn)的選擇性信息。該技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)為先進(jìn)的CellCardCarrier微載體技術(shù),允許多種細(xì)胞株在96孔板的同一孔中進(jìn)行生長并檢測。CellCard的優(yōu)點(diǎn)是增大了檢測容量,提高了檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量,節(jié)省了時(shí)間,降低了成本。但該系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的要求很高,培養(yǎng)環(huán)境必須適合所有被檢細(xì)胞株生長。2.4.2共聚焦顯微成像技術(shù)(fluorescenceconfocalmicroscopeimaging)共聚焦顯微成像技術(shù)采用共聚焦激光微掃描,并結(jié)合數(shù)字化影像和光穩(wěn)熒光染料,特別適合于微量,快速的細(xì)胞水平生物分子的多熒光標(biāo)記檢測,活細(xì)胞和亞細(xì)胞影像分析和多維成像。共聚焦顯微光學(xué)系統(tǒng)如EVOscreen系統(tǒng),能夠做到均質(zhì)檢測,檢測體積小而不損失信號(hào)質(zhì)量。目前利用共聚焦的熒光技術(shù)有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),熒光壽命顯微成像(fluorescencelifetimeimagingmicroscopy,FLIM),光漂白后熒光復(fù)現(xiàn)FRAP(fluorescentrecoveryafterphotobleaching),光漂白熒光損失FLIP(fluorescencelossinphotobleaching),FCS(fluorescencecorrelationspectroscopy)等。2.4.3熒光相關(guān)光譜(fluorescencecorrelationspectroscopy,FCS)FCS是一種超高通量篩選檢測技術(shù),該技術(shù)通過共焦鏡提供高聚激發(fā)光,消除背景可做到單分子檢測,其共聚焦光學(xué)系統(tǒng)使得對(duì)輸出信號(hào)的微量化分析成為可能,FCS可評(píng)價(jià)單個(gè)分子的熒光信號(hào),提供熒光粒子的擴(kuò)散特征信息,可進(jìn)行多參數(shù),多維熒光檢測。FCS能用來監(jiān)測分子結(jié)合時(shí)的相互作用如進(jìn)行受體結(jié)合分析和其他分子事件。OLEG等報(bào)道了采用FCS用于活細(xì)胞篩選GPCR調(diào)節(jié)劑,在3456孔板,最小測活體積小于2μL。2.4.4FLIPR(fluorescentimagingplatereader)FlIPR96和FLIPR384是由MolecularDevices公司開發(fā)的針對(duì)活細(xì)胞熒光檢測鈣流的技術(shù),由于檢測熒光信號(hào)快速、準(zhǔn)確,可達(dá)到亞秒級(jí)水平,允許短暫信號(hào)的檢測,尤其適用于鈣指示劑檢測胞內(nèi)鈣。FLIPR同樣是一種均質(zhì)、動(dòng)態(tài)、細(xì)胞水平的熒光檢測方法,可用于胞內(nèi)鈣離子、鈉離子、膜電位和pH的檢測,但因?yàn)榭克涞臍寮す馓峁┘ぐl(fā)能量,用冷的CCD成像系統(tǒng)檢測,受到光源限制,目前應(yīng)用較多的染料為Fluo-3/AM和calciumgreen。2.4.5FMATTM(fluometricmicrovolumeassaytechnology)是由PEBiosystem開發(fā),基于熒光發(fā)光團(tuán)Cy5,以紅色的633nm氦/氖激光為光源的多孔板掃描技術(shù),可以有效扣除背景,具有較好的檢測靈敏度,也是一種均質(zhì)的活細(xì)胞檢測技術(shù)。FMAT技術(shù)可以應(yīng)用在細(xì)胞因子調(diào)控表達(dá),GPCR,核受體,蛋白-蛋白相互作用,蛋白-核酸相互作用的功能性測定研究中。此外還有應(yīng)用FMAT技術(shù)改良的ELISA一步法的FLISA技術(shù)。除上所述,細(xì)胞水平新的檢測技術(shù)還有Biosignal公司的amplifiedluminescentproximityhomogeneousassayscreen(AlphaScreenTM)技術(shù),Amersham公司和ImagingResearchInc共同開發(fā)的LEADseekerTMHomogeneousImagingsystem,用來取代放射性的親和閃爍分析(SPA)適合的檢測,其靈敏度比SPA高10倍,SurfacePlasmonResonance(SPR)技術(shù),CLIPRsystem(ChemiluminescenceImagingPlateReader)技術(shù),還有納米顆粒偶聯(lián)生物分子也被用在細(xì)胞水平的超敏生物學(xué)檢測中。3細(xì)胞水平的結(jié)構(gòu)-檢測前已述及,細(xì)胞水平的篩選技術(shù)在受體功能研究中應(yīng)用廣泛,以GPCR受體功能研究為例,目前應(yīng)用廣泛的Transflour?技術(shù),其適用于各種GPCR(Gi,Gs,Gq,G12/13)受體功能研究,其原理為不同的GPCR受體與配體相互作用時(shí)激活特定的G蛋白Gα亞單元,并導(dǎo)致相關(guān)的下游信號(hào)的級(jí)聯(lián)激活。而此過程中,均涉及一個(gè)胞漿銜接子(adaptor)蛋白Arrestin,其在幾乎所有的GPCR受體脫敏過程中發(fā)揮作用,Arrestin蛋白從胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜與受體結(jié)合形成復(fù)合體,隨后GPCR受體和其特定G蛋白解偶聯(lián)導(dǎo)致受體脫敏。此外Arrestins蛋白還介導(dǎo)受體的胞漿內(nèi)化并與之結(jié)合,內(nèi)化受體或形成顆粒狀蛋白散布于胞漿中,重新循環(huán)發(fā)揮功能(Resensitization)或在溶酶體中降解。因此利用Arrestin蛋白的轉(zhuǎn)位,結(jié)合和內(nèi)化,將報(bào)告基因和Arrestin蛋白表達(dá)成融合蛋白,可作為GPCR受體功能研究的指示蛋白,用于細(xì)胞水平的高通量篩選。該方法的優(yōu)點(diǎn)是動(dòng)態(tài)直觀,可量化,易操作,且避免了以往GPCR受體研究中因不同的受體亞型激活特定的信號(hào)通路而需要設(shè)計(jì)不同的篩選方法,特別是其適用于無配基的孤兒核受體的功能研究。如Richik等利用報(bào)告基因GFP和Arrestins蛋白表達(dá)成融合蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)U2OS細(xì)胞系進(jìn)行加壓素受體V2R的高內(nèi)涵篩選研究。Yu等利用報(bào)告基因β-半乳糖苷酶的兩個(gè)互補(bǔ)片段分別結(jié)合GPCR受體和Arrestins蛋白用于細(xì)胞水平的β2腎上腺素受體和CXCR2趨化因子受體篩選。除此之外的細(xì)胞水平GPCR受體篩選方法仍有諸多報(bào)道,如前已述及的檢測鈣流的FLIPR技術(shù),檢測信號(hào)分子環(huán)磷腺苷(cAMP)水平采用基于FP和BRET原理的篩選方法等。我國天然產(chǎn)物資源豐富,特別是中藥有效成分具有多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn),可充分發(fā)揮現(xiàn)今細(xì)胞水平篩選多指標(biāo)同時(shí)檢測的獨(dú)特優(yōu)勢,新的細(xì)胞水平篩選方法在天然產(chǎn)物活性篩選和評(píng)價(jià)中得到了充分應(yīng)用。如Ausseil等利用細(xì)胞水平的生物發(fā)光檢測技術(shù),采用人直腸癌細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分子靶標(biāo)4