青蒿琥酯對hela、siha細胞放射增敏作用的研究

青蒿琥酯對hela、siha細胞放射增敏作用的研究

近年來，國內(nèi)外科學家對中藥的治療做出了深入的研究和開發(fā)。1973年，中國科學家從中藥科黃科植物中分離出具有活性的單胞菌黃酮素。青蒿琥酯（Artesunate,Art）是青蒿素的眾多衍生物之一，分子式為C19H28O8，呈無色結晶或白色結晶性粉末，無臭，幾乎無味。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素類藥物作為抗腫瘤藥，其對肝癌、胰腺癌、肺癌等具有明顯的抑制作用。同時鑒于青蒿素及其衍生物內(nèi)的過氧化橋分子結構及其眾多藥理作用，近來對其放射增敏作用機理進行了充分研究。但是青蒿琥酯作為放射增敏藥物，對人宮頸癌細胞作用3研究還未見報道。本實驗將通過細胞輻射損傷實驗，分析研究青蒿琥酯對人宮頸癌細胞的輻射增敏作用。1實驗材料和方法1.1青蒿背景酯、胞松素b、cyt-b染色劑MTT購于上海生工公司；秋水仙素（Colchicine）、胞松素B(CytochatasinB,Cyt-B）、青蒿琥酯、Giemsa染色劑均購于美國Sigma公司；顯微鏡為日本Olympus公司BX51型。1.2實驗方法1.2.1上海細胞庫人宮頸癌HeLa、Siha細胞株，購于中國科學院上海細胞庫。接種細胞在含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基細胞瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，單層貼壁生長。1.2.2吸收劑量測定室溫條件，60Coγ射線，劑量率0.57Gy/min，各組吸收劑量分別為0、2、4和6Gy。試驗在蘇州大學放射醫(yī)學與公共衛(wèi)生學院輻照中心進行。1.2.3藥物的制備青蒿琥酯粉末由5%NaHCO3溶解為5g/L的儲備液，-20℃保存?zhèn)溆?，實驗前用DMEM培養(yǎng)液將其稀釋至實驗所需濃度。1.2.4青蒿違全酶活性檢測青蒿底物a值將處于對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶消化，細胞計數(shù)后，培養(yǎng)液稀釋至濃度為4×104/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24h后，加入配制的青蒿琥酯溶液使終濃度分別為0、1、2、4、8、10、20和40μg/mL，各濃度點設置5個平行樣。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，換培養(yǎng)基，每孔加入5mg/mLMTT20μL，孵育4h，棄上清，每孔加入DMSO100μL，振動5min后，酶標儀（背景波長570nm、參考波長630nm）測吸光度（A）值。計算細胞抑制率：細胞抑制率（%）=（1-各藥物濃度組平均A值/對照組平均A值）×100%。1.2.5體外細胞后細胞的制備取對數(shù)生長期的細胞，以3×105/mL濃度接種于60mm培養(yǎng)皿中，每皿均為2mL細胞懸液，待細胞貼壁后，藥物處理組加入青蒿琥酯溶液，每組均準備四個劑量點樣，每個劑量點準備3個樣，培養(yǎng)24h后進行照射。照后細胞立即更換培養(yǎng)基并加入0.001%秋水仙素20μL，繼續(xù)培養(yǎng)10h。用0.25%胰酶消化并收獲細胞移入試管中，經(jīng)2000r/min離心10min，棄上層培養(yǎng)基，加入2mL37℃預溫的0.075mol/LKCl低滲、新鮮固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定處理、冰玻片常規(guī)滴片、Giemsa染色，制成染色體片。顯微鏡下選擇染色體分散度良好的中期分裂相300個細胞，計數(shù)染色體型畸變：雙著絲粒體（dic）+著絲粒環(huán)（r）、染色體斷片。1.2.6顯微染色，觀察組微核片的制備照射前及照射中處理與常規(guī)染色體畸變法相同，照后細胞立即更換培養(yǎng)基并加入Cyt-B（終濃度為4mg/L），繼續(xù)培養(yǎng)24h。用0.25%胰蛋白酶消化并收獲細胞移入試管中，經(jīng)1,000r/min離心10min，棄上層培養(yǎng)基，加入2mL37℃預溫的0.075mol/LKCl低滲處理，新鮮固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定處理、常規(guī)滴片、Giemsa染色，制備完整細胞微核片。顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)標準(1)雙核細胞：胞體較大，胞核為2個，此系經(jīng)過一次分裂并被Cyt-B阻滯所致。染色質(zhì)較細致、疏松，核仁多清晰可見，胞漿豐富。(2)微核鑒別標準：微核必須位于雙核細胞質(zhì)中，與主核完全分開，如有重疊或相切，必須看到各自完整的核膜；微核呈圓形或橢圓形，直徑小于主核的1/3；無折光性；著色與主核相同或略淺。(3)分析細胞：油鏡下（10×100）計數(shù)，其中所含微核的細胞比率、微核的比率分別為微核細胞率（MNCF）、微核率（MNF），以千分率（‰）表示。1.3染色體畸變試驗實驗結果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，對照組與處理組間比較采用t檢驗，各劑量組間差異采用One-wayANOVA分析，染色體畸變率、MNCF、MNF與劑量間的關系采用直線回歸與相關分析。p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果和分析2.1青蒿表現(xiàn)對hela、siha細胞的輻射損傷作用從表1中可見，青蒿琥酯作用于HeLa及Siha細胞24h后，其對細胞的抑制率隨藥物濃度的增加而增加（p<0.01）。在藥物濃度分別為2μg/mL、4μg/mL時，青蒿琥酯對HeLa、Siha細胞的抑制作用較小，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05），故為減小藥物對細胞的毒性作用及最大程度的增加藥物的放射增敏效果，并使以下試驗中藥物對兩種細胞株的影響大致相同，確定HeLa、Siha細胞的輻射損傷試驗將分別采用藥物濃度2μg/mL、4μg/mL。2.2輻照對hela細胞回歸方程的影響HeLa、Siha細胞經(jīng)60Coγ射線單純照射組、藥物處理聯(lián)合輻照組，雙著絲粒體（dic）+著絲粒環(huán)（r）、染色體斷片結果見表2和表3，并發(fā)現(xiàn)HeLa、Siha細胞中染色體數(shù)目均為為非整倍體。從表2和表3中可見，同組HeLa或Siha細胞中的dic+r及染色體斷片率均隨著受照劑量的增加而增大。HeLa細胞在2、4和6Gy劑量下，與相同劑量輻照的單純照射組dic+r及染色體斷片率均低于藥物處理組（p<0.05），而Siha細胞藥物處理組與單純照射組的dic+r及染色體斷片率均無明顯統(tǒng)計學差異（p>0.05）。在未予輻照的情況下，加藥處理組與單純照射組結果差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。從表2和表3數(shù)據(jù)相關分析表明，HeLa或Siha細胞單純照射組和藥物處理組的dic+r及染色體斷片率均與輻照劑量成正相關。應用SPSS軟件回歸分析擬合二次回歸方程：HeLa細胞二次回歸方程單純照射組dic+r率：藥物處理組dic+r率：單純照射組染色體斷片率：藥物處理組染色體斷片率：Siha細胞二次回歸方程藥物處理組dic+r率：單純照射組染色體斷片率：藥物處理組染色體斷片率：式中，Y為染色體畸變率（%），D為受照劑量（Gy）。從以上回歸方程可看出dic+r率的線性方程為直線平方方程，而染色體斷片率為直線方程，擬合度均良好，回歸系數(shù)有高度的統(tǒng)計意義（p<0.01）。2.3輻照對mnpf和mnf的影響HeLa、Siha細胞經(jīng)60Coγ射線輻照單純照射組、藥物處理組微核細胞率、微核率計數(shù)結果見表4和表5。從表4和表5中可見，HeLa或Siha細胞的MNCF與MNF均隨照射劑量增加而增加（p<0.01）。HeLa細胞在2、4和6Gy劑量下，與相同劑量輻照的單純照射組與藥物處理組的MNCF存在明顯差別，具有統(tǒng)計學意義（p<0.05），另一指標MNF的差別亦有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；而Siha細胞藥物處理組與單純照射組的MNCF或MNF均無明顯統(tǒng)計學差異（p>0.05）。HeLa或Siha細胞在未予輻照的情況下，加藥處理組與單純照射組結果差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。從表4和表5數(shù)據(jù)相關分析表明，HeLa或Siha細胞單純照射組和藥物處理組的MNCF與MNF均與輻照劑量成正相關。應用SPSS軟件回歸分析擬合二次回歸方程：HeLa細胞二次回歸方程單純照射組微核細胞率：藥物處理組微核細胞率：單純照射組微核率：藥物處理組微核率：Siha細胞二次回歸方程單純照射組微核細胞率：藥物處理組微核細胞率：單純照射組微核率：藥物處理組微核率：式中，Y為微核率或微核細胞率(‰)，D為照射劑量(Gy)。線性方程擬合度均良好，回歸系數(shù)有高度的統(tǒng)計意義（p<0.01）。3青蒿素輻射增敏機制我們在選擇了對實驗細胞毒性較小的藥物濃度這個前提下，實驗結果顯示：相同輻照劑量下，Hela細胞經(jīng)青蒿琥酯聯(lián)合輻照處理后，染色體雙著絲粒體+環(huán)、染色體斷片率、微核細胞率、微核率均較單純照射組明顯增高，而Siha細胞相應的指標并無統(tǒng)計學差異。結果表明，青蒿琥酯對Hela細胞具有放射增敏性，對Siha細胞無放射增敏性。對于青蒿素類藥物的放射增敏機制國內(nèi)外進行了廣泛的研究，其機制較為復雜，有著眾多激酶參與，并與周期調(diào)控有關。文獻報道了二氫青蒿素的輻射增敏機制與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）表達降低及轉(zhuǎn)鐵蛋白量增加有關。我們課題組前期對青蒿素類藥物的輻射增敏機制進行了深入探討，發(fā)現(xiàn)青蒿素能通過降低細胞周期蛋白wee1的表達量，增高cyclinB1的表達量，減弱p53突變基因細胞輻照后誘導的G2/M期阻滯效應，使細胞的輻射損傷更為明顯，并且青蒿素能明顯提高輻照后細胞的微核率。細胞從G2期進入M期的主要調(diào)節(jié)因素是Cdc2/CyclinB蛋白復合體。Cdc2一方面與CyclinB1相結合發(fā)揮功能；另一方面也受磷酸化影響被抑制活性。Thr-161磷酸化是Cdc2激酶活性所需的，而Thr-14和Tyr-15磷酸化則抑制Cdc2激酶活性。Weel則是控制Cdc2的Tyr-15磷酸化的主要激酶。Hela是p53基因突變細胞，其受到輻射損傷后只能通過G2期阻滯來進