實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time-PCR )

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QuantitativeReal-time-PCR)什么是qPCR、Real-time-PCR？Real-time-PCR和qPCR（QuantitativeReal-time-PCR）都是實(shí)時(shí)定量PCR，指的是PCR過(guò)程中每個(gè)循環(huán)都有數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)記錄，因此可以對(duì)起始模板數(shù)量進(jìn)行精確的分析。

雖然Real-timePCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）和ReversetranscriptionPCR（反轉(zhuǎn)錄PCR）看起來(lái)都可以縮寫(xiě)為RT-PCR，但是，國(guó)際上的約定俗成的是：RT-PCR特指反轉(zhuǎn)錄PCR，而Real-timePCR一般縮寫(xiě)為qPCR（quantitativereal-timePCR）。Real-time-PCR的前驅(qū)步驟細(xì)胞/組織RNA的提取。逆轉(zhuǎn)錄PCR或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。Real-time-PCR的原理熒光染料：熒光染料也稱DNA結(jié)合染料，目前主要使用的染料分子是SYBRGreenI，SYBRGreenI能與DNA雙鏈的小溝特異性的結(jié)合，游離的SYBRGreenI幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)，但結(jié)合雙鏈DNA后，其熒光信號(hào)可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加，PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量也增大，其熒光信號(hào)強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBRGreenI方法是一種最基礎(chǔ)也最常用的Real-timeqPCR實(shí)驗(yàn)手段。PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，降溫至60℃，然后加熱升溫至95℃變性DNA產(chǎn)物。變性

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高溫孵育將dsDNA變成成單鏈，并松弛ssDNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)。退火

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退火期間，互補(bǔ)序列結(jié)合。延伸

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70-72℃，DNA聚合酶活性最佳，并且以每秒100個(gè)堿基的速率延伸。當(dāng)qPCR中的產(chǎn)物長(zhǎng)度較小時(shí)，此步驟可與退火在60℃同步進(jìn)行。不同公司的SYBRGreen需要的上機(jī)條件略有不同，具體參考書(shū)明書(shū)。Real-time-PCR的原理在Real-timeqPCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線，即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。擴(kuò)增早期，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化，此時(shí)即為基線期。在熒光信號(hào)的指數(shù)增長(zhǎng)期，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，一般選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析?；€期平臺(tái)期擴(kuò)增期檢測(cè)指標(biāo)：CT值閾值循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold，Ct值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。這就是熒光定量PCR的理論基礎(chǔ)。數(shù)據(jù)分析相對(duì)定量，不像絕對(duì)量化嚴(yán)格，應(yīng)用于大多數(shù)基因表達(dá)水研究。相對(duì)定量關(guān)注的并非某個(gè)基因的絕對(duì)表達(dá)量，而是同一基因在樣本間的表達(dá)差異(如實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)。結(jié)果以處理組相對(duì)于未處理組的表達(dá)差異倍數(shù)表示。這種分析方法不需要測(cè)定精確的拷貝數(shù)，重點(diǎn)是在與未處理樣品組相比的表達(dá)變化上。相對(duì)定量算法—ΔΔCt,ΔΔCt方法是比較組別間同一基因表達(dá)差異的常用方法。通過(guò)將目的基因Ct(Ct目的)與自身內(nèi)參Ct值（Ct內(nèi)參）進(jìn)行比較，可得到每一組別的ΔCt，再將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行計(jì)算得到ΔΔCt。ΔΔCt的大小關(guān)聯(lián)目的基因表達(dá)水平的倍數(shù)差異大小。倍數(shù)差異=2^-ΔΔCtΔCt實(shí)驗(yàn)組–ΔCt對(duì)照組=ΔΔCtCt目的實(shí)–Ct內(nèi)參實(shí)=ΔCt實(shí)驗(yàn)組Ct目的對(duì)–Ct內(nèi)參對(duì)照=ΔCt對(duì)照組常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案擴(kuò)增曲線形狀異常擴(kuò)增曲線不光滑:信號(hào)太弱，經(jīng)系統(tǒng)矯正后產(chǎn)生。提高模板濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增曲線斷裂或下滑:模板濃度較高，基線的終點(diǎn)值大于C值。減小基線終點(diǎn)(CT值-

4)，重新分析數(shù)據(jù)。個(gè)別擴(kuò)增曲線突然驟降:反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡。處理樣本時(shí)要注意離心，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)之前要仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。反應(yīng)結(jié)束無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠:一般設(shè)置循環(huán)數(shù)為40，但需要注意的是過(guò)多的循環(huán)會(huì)增加過(guò)多的背景信號(hào)，降低數(shù)據(jù)可信度。確認(rèn)程序中是否設(shè)置了信號(hào)采集步驟:兩步法擴(kuò)增程序一般將信號(hào)采集設(shè)置在退火延伸階段;三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號(hào)采集設(shè)置在72C延伸階段。確認(rèn)引物是否降解:長(zhǎng)時(shí)間未用的引物應(yīng)先通過(guò)電泳檢測(cè)完整性，以排除其降解的可能。模板濃度太低:減少稅釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。模板降解:重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。CT值出現(xiàn)太晚擴(kuò)增效率極低:優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計(jì)合成引物。模板濃度太低:減少稅釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。模板降解:重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。PCR產(chǎn)物太長(zhǎng):推薦PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為80-150bp。體系中存在PCR抑制劑:一般為模板帶入，加大模板梯釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。陰性對(duì)照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增反應(yīng)體系污染:更換新的濕合料、ddH0、引物重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反虛體系在超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，減少氣溶膠污染。引物二聚體的出現(xiàn):配合熔解曲線進(jìn)行分析。絕對(duì)定量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳加樣誤差:提高模板稀釋倍數(shù)，提高加樣體職。標(biāo)準(zhǔn)品降解:重新制備標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。模板濃度太高:提高模板釋倍數(shù)。熔解曲線出現(xiàn)多峰引物設(shè)計(jì)不優(yōu):根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成新的引物。引物濃度太高:適當(dāng)降低引物濃度。cD