牛胚胎移植技術(shù)的研究進(jìn)展

牛胚胎移植技術(shù)的研究進(jìn)展

胚胎移植（et）是指從同一異質(zhì)母牛的原始胚胎中移植到同一生理狀態(tài)的母牛，并繼續(xù)發(fā)展為一個(gè)新個(gè)體。此項(xiàng)技術(shù)對(duì)提高優(yōu)秀母畜的繁殖力、加快遺傳進(jìn)展、增加肉用畜種的雙胎率、克服母畜不孕癥、降低引種費(fèi)用、減少疾病傳播等方面均具有重要價(jià)值。本文就牛胚胎移植技術(shù)的研究和應(yīng)用現(xiàn)狀做一綜述。1牛胚胎移植技術(shù)的發(fā)展1.1牛胚胎的研發(fā)胚胎移植在兔上首次試驗(yàn)成功(Heape,1890),距今已有110多年的研究發(fā)展歷史。1951,Willett首次成功地進(jìn)行了牛的胚胎移植。20世紀(jì)60年代,英、法、加、美、日等國(guó)對(duì)牛胚胎移植的技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行了大量研究。1975年1月在美國(guó)科羅拉多州召開了第一屆國(guó)際胚胎移植學(xué)會(huì)成立大會(huì)。1976年牛的非手術(shù)法胚胎移植成功,1977年開始進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用,13個(gè)國(guó)家成立了數(shù)百家商業(yè)性的胚胎移植公司。據(jù)統(tǒng)計(jì),1978年后僅北美地區(qū)每年生產(chǎn)近10萬(wàn)頭胚胎移植犢牛,其中奶牛占30%。截止1990年,美國(guó)登記的胚胎移植荷斯坦奶牛總量已達(dá)到142598頭,美國(guó)荷斯坦奶牛核心群母牛的27.5%和優(yōu)秀種公牛的44%來(lái)自胚胎移植產(chǎn)生的后代。日本的荒本獸醫(yī)科診所于1986～1992年在熊本縣菊池郡管區(qū)對(duì)85戶農(nóng)民飼養(yǎng)的6000頭奶牛進(jìn)行了胚胎移植研究,受胎率59%,獲得1980頭移植犢牛。到1986年,加拿大登記應(yīng)用胚胎移植獲得的犢牛達(dá)18079頭,其中一頭最優(yōu)秀的母牛已生產(chǎn)了86頭胚胎移植小牛,擁有18頭以上不同的后裔,同時(shí)還有8頭自然出生的小牛。在歐洲牛冷凍胚胎的使用率達(dá)47.8%。牛胚胎移植的增長(zhǎng)速度非常快,1991年全世界移植受體240730頭,到1996年增加到412573頭。目前,據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)全世界年產(chǎn)胚胎移植牛超過(guò)了35萬(wàn)頭。1.2奶牛胚胎移植情況我國(guó)牛胚胎移植技術(shù)的研究和應(yīng)用起步較晚。1978年,中科院遺傳研究所和上海市牛奶公司用手術(shù)法得到了第一頭胚胎移植犢牛。1980年采用非手術(shù)移植法獲得了胚胎移植犢牛。在20世紀(jì)80年代中期以前,我國(guó)牛胚胎移植處于試驗(yàn)研究階段。此階段試驗(yàn)頭數(shù)少,水平低,以鮮胚移植為主。據(jù)報(bào)道,蘆臺(tái)農(nóng)場(chǎng)奶牛實(shí)驗(yàn)站等11個(gè)單位于1983～1984年間共超排奶牛329頭,頭均獲胚胎2.9枚,其中可用胚胎1.5枚。鮮胚移植受體160頭,妊娠38頭,移植妊娠率為23.8%。同時(shí)多個(gè)單位還開展了冷凍胚胎的研究,共移植29頭受體,妊娠5頭,移植妊娠率僅為17.2%。20世紀(jì)80年代中期至90年代中期,我國(guó)牛胚胎移植技術(shù)進(jìn)入發(fā)展提高階段。這時(shí)開展此項(xiàng)研究的單位增多、群體規(guī)模增大,水平有所提高,冷凍胚胎比例增大。據(jù)統(tǒng)計(jì),1986～1988年期間,蘆臺(tái)農(nóng)場(chǎng)奶牛實(shí)驗(yàn)站等單位共超排奶牛1501頭次,頭均獲胚胎5.6枚,可用胚胎3.6枚;新鮮胚胎移植妊娠率為39.4%,冷凍胚胎移植妊娠率為21.5%,凍胚移植比例為37.2%。據(jù)陳靜波、郭志勤等(1995)報(bào)道,新疆家畜生物工程實(shí)驗(yàn)中心1991～1994年共超排402頭次,獲可用胚胎2024枚,頭均5.04枚;鮮胚移植1040頭,產(chǎn)犢519頭,產(chǎn)犢率49.9%,凍胚移植173頭,產(chǎn)犢45頭,產(chǎn)犢率26.0%。20世紀(jì)90年代中期后,我國(guó)牛胚胎移植技術(shù)進(jìn)入推廣應(yīng)用階段,并逐步向產(chǎn)業(yè)化階段邁進(jìn)。中國(guó)農(nóng)科院畜牧研究所羅應(yīng)榮、朱化彬等(2001)報(bào)道,1996～2000年,北京奶牛中心和黑龍江畜牧研究所共超排奶牛857頭次,獲可用胚胎5067枚,頭均5.91枚,移植受體2123頭,移植妊娠率51.76%。郭志勤等(2001)報(bào)道,1998～2001年間,新疆處理供體牛806頭,獲可用胚胎4743枚,平均5.88枚;鮮胚移植受體牛501頭,妊娠311頭,妊娠率62.08%;凍胚移植2820頭,妊娠1413頭,受胎率50.11%。桑潤(rùn)滋(2000)報(bào)道,河北、山東、河南1996～1997年從國(guó)外引進(jìn)西門塔爾、利木贊、夏洛來(lái)等肉牛凍胚,移植受體600頭,妊娠241頭,移植妊娠率40%。本世紀(jì)初,我國(guó)胚胎移植技術(shù)得到了很快的發(fā)展。為加快奶牛胚胎移植產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程,2002年初農(nóng)業(yè)部實(shí)施了“萬(wàn)枚高產(chǎn)奶牛胚胎移植富民工程”項(xiàng)目,在內(nèi)蒙古、新疆、北京、陜西、山西、河北、山東七省市廣泛開展了奶牛胚胎移植的大規(guī)模示范推廣,取得了顯著效果。“十五”期間國(guó)家投資1.5億元,在河北、北京、上海、黑龍江、內(nèi)蒙古等省、(市)實(shí)施的“奶業(yè)重大關(guān)鍵技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)化技術(shù)集成示范”項(xiàng)目,明確規(guī)定利用胚胎移植技術(shù)培育高產(chǎn)核心牛群數(shù)萬(wàn)頭。目前,我國(guó)已有20多個(gè)省市開展了家畜胚胎移植及相關(guān)生物技術(shù)的研究與推廣工作,且有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢(shì)。2牛胚胎移植的技術(shù)方法和注意事項(xiàng)2.1期外看,以供體牛和受體的正常發(fā)情周期為依托,增加日糧,保證引食期及日糧在體的安全和病毒的補(bǔ)充,是論證超排、變更來(lái)確定的依據(jù)供體要符合品種標(biāo)準(zhǔn),具有優(yōu)良生產(chǎn)性能和育種價(jià)值,沒(méi)有遺傳疾病,繁殖機(jī)能旺盛,體質(zhì)健壯,年齡3～8歲,膘情適中。產(chǎn)后6～9周的母牛不宜做供體,同一頭牛在一個(gè)泌乳期內(nèi)不宜做兩次以上超排處理。超排前供體牛血清孕酮含量3.0ng/mL或以上,總膽固醇含量140ng/100mL以上,可作為選擇供體牛的參考指標(biāo)。據(jù)統(tǒng)計(jì),按上述標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格選擇供體牛,可獲得超排率80%以上。受體要選體格較大,膘情好,繁殖機(jī)能正常的適繁健康母牛。根據(jù)供、受體牛群的營(yíng)養(yǎng)狀況,在超排前30～45d開始調(diào)整日糧,增加日糧中青綠飼料、維生素和微量元素的補(bǔ)充。供、受體牛群至少要連續(xù)觀察兩個(gè)正常發(fā)情周期,才能保證超排、同期發(fā)情和受胎效果。供受體牛比例一般為1:6～8。2.2超排劑量的確定牛的超排處理一般采用FSH減量注射法。即在供體牛發(fā)情后的9～13d(查黃體)肌注FSH,早晚各一次,間隔12h,分4d減量注射。在第3d時(shí)同時(shí)肌注PGF2α4mg。超排劑量應(yīng)根據(jù)激素的國(guó)別、廠家和供體大小確定,國(guó)產(chǎn)FSH一般為320～360u,進(jìn)口一般為28～36mg。超排處理前的母?？刹捎迷屑に刈黝A(yù)處理來(lái)提高母畜對(duì)促性腺激素的敏感性,增強(qiáng)超排效果。2.3牛肉的接受、檢查、不動(dòng)通常要求從肌注PGF2α第2d傍晚開始觀察母牛發(fā)情情況,至少早晚各觀察一次,以母牛接受爬跨、站立不動(dòng)為主要判定標(biāo)準(zhǔn)。在觀察到供體牛穩(wěn)定接受爬跨后4～6h進(jìn)行第一次輸精,輸精間隔為10h～12h,輸精次數(shù)3次左右為宜,每次輸入符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的冷凍精液至少2個(gè)劑量。2.4含量、發(fā)酵時(shí)間及管道一般采用兩次前列腺素注射法。在不知發(fā)情周期的情況下,間隔11d,兩次肌注PGF2α。處理的日程安排應(yīng)與供體牛超排處理相吻合。應(yīng)根據(jù)母牛接受爬跨的情況觀察發(fā)情,早、晚各30min。對(duì)發(fā)情牛需做直檢以確認(rèn)卵泡發(fā)育狀態(tài),次日上午或晚上確定是否排卵,在發(fā)情36h以后排卵的牛一般不能作受體。實(shí)際移植時(shí),可按胚胎發(fā)育情況選受體牛的發(fā)情日差,可將致密桑椹胚移植給發(fā)情6d的受體牛,將早期囊胚移植給發(fā)情7d的受體牛,將囊胚和擴(kuò)大囊胚移植給發(fā)情8d的受體牛。2.5胚胎收集2.5.1確定受體頭數(shù)以發(fā)情日為第0d,在第5～6d檢查卵巢確定黃體數(shù),以便安排受體頭數(shù)。第7d(或第6～8d)回收卵。術(shù)前應(yīng)斷水絕食24h,以減小腹壓和瘤胃的壓力。2.5.2吊瓶和灌流對(duì)測(cè)定滅菌處理過(guò)的沖卵管用PBS液沖洗2～3次,插入鋼芯,檢查氣球。在無(wú)菌間用導(dǎo)管連接吊瓶和集卵杯灌流裝置。裝入PBS液的吊瓶在37℃水浴中預(yù)溫待用。準(zhǔn)備好必要的麻醉劑、注射器、酒精棉和沖洗消毒劑等。2.5.3牛保定和麻醉供體牛保定完畢后,在第一、二尾椎骨間酒精消毒,用2%普魯卡因3～5mL作硬膜外麻醉或肌注2%靜松靈1mL。2.5.4糞便的消毒麻醉后將牛尾豎直綁在保定架上,清除糞便,用清水沖洗會(huì)陰部,再用高錳酸鉀液沖洗消毒,用滅菌衛(wèi)生紙擦干,最后用酒精棉球消毒,生理棉球擦洗。2.5.5誘導(dǎo)沖卵管入引助手將準(zhǔn)備好的沖卵管交給術(shù)者,術(shù)者用一手食指和拇指扒開陰門插入沖卵管,再將另一手伸入直腸,仔細(xì)小心地誘導(dǎo)沖卵管經(jīng)子宮頸進(jìn)入一側(cè)子宮角至大彎處,抽出少許鋼芯,再將沖卵管向前推,使其尖端靠近子宮角深部。由助手持30mL注射器一次推入空氣,一般青年牛充氣14～16mL,經(jīng)產(chǎn)牛為18～25mL。沖卵管固定后抽出鋼芯,開始灌流。2.5.6單位面積20%術(shù)者左手通過(guò)直腸輔助按摩子宮角。每次灌注30～50mL,由少到多,每側(cè)子宮角沖8～10次,每側(cè)總量為300～500mL,回收后注入加蓋量筒。全過(guò)程需在室溫(25℃左右)操作。2.5.7術(shù)后處理兩側(cè)子宮角沖卵完成后,放出一部分空氣,將沖卵管抽至子宮體灌注80萬(wàn)單位青霉素和100萬(wàn)單位鏈霉素,拔出沖卵管。2.6觀察胚胎形態(tài)和發(fā)育狀況撿胚室的溫度要維持在25℃左右。撿胚時(shí),先將回收液用集卵杯過(guò)濾,把剩余液體分批到入平皿中,用揀卵針撥開異物,將所有胚胎吸入新鮮的保存液中,再用新鮮的保存液洗滌2～3次,然后置于100～200倍體視顯微鏡下,觀察胚胎形態(tài)和發(fā)育狀況。若卵子卵黃未形成卵裂球,則為未受精卵。A級(jí)胚胎:呈球形,輪廓清晰,卵裂球大小均勻,胚內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊湊,色調(diào)和透明度適中,無(wú)附著的細(xì)胞和液泡;B級(jí)胚胎:輪廓清晰,色調(diào)和細(xì)胞密度良好,有少量附著的細(xì)胞和液泡,變性細(xì)胞占10%～30%;C級(jí)胚胎:輪廓不清,色調(diào)暗,結(jié)構(gòu)松散,游離的細(xì)胞和液泡較多,變性細(xì)胞占30%～50%。A、B、C級(jí)胚胎可用于鮮胚移植,A、B級(jí)胚胎可用于冷凍;其它胚胎和未受精卵一并棄去。操作時(shí)應(yīng)避免損傷胚胎。2.7胎盤移植牛胚胎移植常用非手術(shù)法。2.7.1兩組患者發(fā)發(fā)發(fā)發(fā)發(fā)發(fā)時(shí)兩組見(jiàn)表1要求受體牛發(fā)情直檢時(shí)卵泡直徑在10～20mm左右,發(fā)情后36h內(nèi)出現(xiàn)排卵。移植前一天直檢黃體,其直徑在11～15mm以上,黃體的手感彈性好,質(zhì)地軟而充實(shí)。2.7.2移植槍的消毒用金屬移植器,需先將移植槍、槍頭及金屬保護(hù)外套分別用紙包扎好,高壓消毒。塑料卡蘇式移植槍需經(jīng)氣體滅菌。移植時(shí),先用75%酒精棉球消毒裝有胚胎的塑料吸管,然后剪掉封口一端,裝入移植槍內(nèi),套上保護(hù)外套。2.7.3安裝管道可用0.25mL細(xì)管分三段吸入PBS保存液,中間由兩個(gè)氣泡隔開,中段含有胚胎。2.7.4普魯卡因dml有5l的尾腰椎間硬膜外麻醉將受體牛保定,肌注2%靜松靈1mL或用2%的普魯卡因3mL在1、2尾椎間硬膜外麻醉。清洗外陰,用高錳酸鉀水消毒,用滅菌紙擦干,最后用酒精棉球消毒,生理棉球擦洗。2.7.5大可插之巖,開應(yīng)當(dāng)去宮口術(shù)者用一手扒開外陰,另一手持移植器插入陰道。然后左手伸進(jìn)直腸,移植槍到達(dá)子宮頸口時(shí),右手用力將移植槍捅破外套,插入子宮頸。左手在直腸內(nèi)誘導(dǎo)使槍頭輕輕穩(wěn)妥地插入黃體側(cè)子宮角至大彎處,持移植器的右手推出胚胎,緩慢旋轉(zhuǎn)地抽出移植槍。2.8供體的折返時(shí)間胚胎移植后,應(yīng)密切觀察供、受體術(shù)后的健康情況,并留意它們?cè)陬A(yù)定的時(shí)間內(nèi)是否會(huì)返情。供體在第二次發(fā)情時(shí)即可照常配種,或經(jīng)過(guò)2～3個(gè)月后可重復(fù)做供體。受體母牛移植后要進(jìn)行妊娠診斷,確認(rèn)妊娠的母牛,要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,防止流產(chǎn)。3牛胚胎移植的問(wèn)題和發(fā)展趨勢(shì)3.1牛胚胎移植的問(wèn)題成本高、效率低、無(wú)明確的組織機(jī)構(gòu)、技術(shù)人員缺乏、高產(chǎn)牛比例低等弊端是目前我國(guó)牛胚胎移植的推廣應(yīng)用中存在的主要問(wèn)題。3.2牛胚胎移植的現(xiàn)狀胚胎移植技術(shù)有