mirnas芯片技術(shù)在鼻咽癌細胞差異表達中的應(yīng)用

mirnas芯片技術(shù)在鼻咽癌細胞差異表達中的應(yīng)用

mirna是一個非常保守的非編碼性rna（nodcod）。一般來說，19.25nm鏈內(nèi)的nad可由60.110nm的內(nèi)部采樣前體加工形成。它們廣泛存在于植物、動物以及病毒中。miRNA與靶mRNA的3’UTR堿基配對,通過抑制mRNA的翻譯或直接使mRNA降解,在轉(zhuǎn)錄后水平使基因產(chǎn)生沉默。越來越多的證據(jù)顯示由miRNA調(diào)節(jié)的基因調(diào)控機制作為基因表達水平調(diào)控的一種重要方式,與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),miRNAs很可能是一類潛在的癌基因或抑癌基因。對慢性淋巴細胞白血病(chroniclymphocyticleukemia,CLL)的研究發(fā)現(xiàn)mir-15a和mir-16-1位于13q14染色體缺失域,50%~60%的CLL的患者存在mir-16-1和/或mir-15a的表達下調(diào),而miR-143和miR-145在結(jié)腸癌中表達下調(diào),Let-7在肺癌細胞中表達下調(diào),RAS可能受到Let-7的調(diào)控,并且50%以上的miRNAs的基因位于在人類癌癥中發(fā)生缺失、擴增的染色體區(qū)域或染色體脆性位點,進一步表明了miRNAs與人類癌癥的相關(guān)性。鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)是我國南方地區(qū)常見的惡性腫瘤。目前認為,遺傳因素、EB病毒感染和某些環(huán)境因素與鼻咽癌的發(fā)生有關(guān),但具體的分子發(fā)生機制尚不清楚。本研究應(yīng)用miRNAs芯片篩查了原代培養(yǎng)的鼻咽癌和正常鼻咽上皮細胞差異表達的miRNAs,并在對差異表達的miRNAs進行靶基因的預(yù)測的基礎(chǔ)上進一步對其靶基因進了行驗證,為進一步研究其在鼻咽癌發(fā)病機制中的作用打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1患者鼻嗅正常上皮細胞標本來源5例原代培養(yǎng)鼻咽癌細胞(NPC8、NPC31、NPC43、NPC44和NPC47)及5例原代培養(yǎng)鼻咽正常上皮細胞(NPNE5、NPNE7、NPNE10、NPNE12和NPNE13)標本均來源于中山大學(xué)腫瘤防治中心鼻咽科門診。患者均為未接受過治療的門診病人。鼻咽癌細胞株C666由中山大學(xué)附屬腫瘤防治中心實驗研究部凍存。1.2方法1.2.1生物學(xué)特性的鑒定鼻咽原代細胞的培養(yǎng)方法參見文獻,其中用于芯片的鼻咽原代細胞均經(jīng)過生物學(xué)特性的鑒定(資料未發(fā)表)。C666細胞用RMPI1640培養(yǎng)基(含有10%的FBS、50mg/L鏈霉素和50mg/L青霉素),細胞置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中。1.2.2總rna的濃縮取對數(shù)生長期細胞,Trizol一步法提取細胞總RNA,異丙醇沉淀法濃縮RNA,分光光度計測定總RNA的純度,甲醛變性膠電泳質(zhì)檢總RNA的質(zhì)量。取50~100μg總RNA用miRNAIsolationKit分離小于100nt的小分子RNA,具體方法按說明書進行。1.2.3mirna芯片的交叉和分析1.2.4mirna的預(yù)測靶基因應(yīng)用互聯(lián)網(wǎng)上miRNA靶基因預(yù)測軟件(Pictar、Targetscan、MiRbase、MiRanda)在線服務(wù)站點,輸出差異表達miRNA的預(yù)測靶基因,取至少3個軟件預(yù)測到的基因作為靶基因。1.2.5r-pcr檢測1.2.6原代細胞trizel的提取分別取2例鼻咽癌原代細胞(NPC43,NPC44)和1例鼻咽正常上皮原代細胞(NPNE5)Trizol提取RNA后的剩余液,按照Trizol試劑說明書提取蛋白,-80℃保存待用。鼠抗人SPARC單克隆抗體;兔抗人CCNG1多克隆抗體均購自DAKO公司。2結(jié)果2.1mirnas芯片的檢測樣品總RNA的OD260/OD280之值在1.8~2.0之間。甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,條帶清晰,28S比18SRNA條帶亮度接近2∶1,RNA完好無降解,質(zhì)量符合miRNAs芯片的質(zhì)量要求(圖1)。經(jīng)miRNAIsolationKit分離,分別獲得C666、5例鼻咽癌原代細胞(NPC8、NPC31、NPC43、NPC44和NPC47)及5例正常鼻咽上皮原代細胞(NPNE5、NPNE7、NPNE10、NPNE12和NPNE13)的小分子RNA。2.2mirnas檢測分別將NPNE7和NPNE10,NPNE5、NPNE12和NPNE13樣本小RNA混合后與芯片雜交,NPC8、NPC31、NPC43、NPC44和NPC47樣本小RNA分別與芯片雜交。雜交芯片經(jīng)過掃描和數(shù)據(jù)整理后應(yīng)用Cluster和SAM軟件輸出,得到miRNA表達譜和差異表達miRNA(表2)。應(yīng)用非監(jiān)督等級聚類(unsupervisedhierarchicalclustering)的方法將原代培養(yǎng)的鼻咽癌和正常鼻咽上皮細胞的miRNA放到一起聚類,得到原代培養(yǎng)的鼻咽癌和正常鼻咽上皮細胞miRNA表達譜(圖2)。結(jié)果顯示在原代培養(yǎng)的鼻咽癌和正常鼻咽上皮細胞中l(wèi)et-7家族、miR-29、miR-23、miR-24、miR-22和miR-221等高表達。應(yīng)用SAM軟件twoclassunpaired的方法篩選出24個鼻咽癌相關(guān)miRNAs,包括18個在鼻咽癌表達下調(diào)的miRNAs和6個在鼻咽癌表達上調(diào)的miRNAs。其中在鼻咽癌表達下調(diào)2倍以上的有:miR-203、miR-503、miR-424、miR-141和miR-148a共5個。在鼻咽癌表達上調(diào)2倍以上的有:miR-25、miR-195和miR-15a共3個。2.3mir-15a在pcr擴增和溶解實驗中的表達分析采用熒光定量RT-PCR的方法檢測了芯片中顯示表達下調(diào)的miR-203在幾個原代培養(yǎng)的鼻咽癌和正常鼻咽上皮細胞中的表達,同時對表達上調(diào)的miR-195,miR-25,miR-15a在NPC47的表達進行了檢測,并采用U6進行歸一化。miRNAs定量PCR擴增曲線和溶解曲線(圖3),顯示溶解曲線呈單峰,引物的特異性較好。我們又將芯片結(jié)果與熒光定量RT-PCR結(jié)果進行比較(圖4),結(jié)果顯示在NPC31、43、44、47中miR-203表達下調(diào);在NPC47中miR-195,miR-25,miR-15a表達上調(diào),miRNA芯片與定量RTPCR的結(jié)果一致,說明本研究芯片結(jié)果真實可靠。2.4mir-203靶基因的篩選選擇鼻咽癌下調(diào)的miR-203進行靶基因的預(yù)測。通過四個靶點預(yù)測軟件(pictar,targetscan,miRanda,miRBase)預(yù)測miR-203可能的靶基因。為了減少假陽性率,我們只挑選至少出現(xiàn)在3個軟件中的基因作為其可能的靶基因,共篩選出46個基因。我們將先前預(yù)測的靶基因與全基因組差異基因表達譜相比較發(fā)現(xiàn),在這46個預(yù)測的靶基因中,有5個基因表現(xiàn)為上調(diào)表達,它們是:SPARC,CCNG1,ID2,INSIG1和CITED2,有3個基因表現(xiàn)為下調(diào)表達,其余基因無明顯變化或者無數(shù)據(jù)。2.5原代培養(yǎng)的凈化細胞中ccng1和sarc蛋白表達檢測在原代培養(yǎng)的鼻咽癌細胞中下調(diào)表達的miR-203,其預(yù)測兩個的靶基因是CCNG和SPARC。它們在原代培養(yǎng)的鼻咽癌全基因組表達譜芯片中表達都上調(diào),進一步利用Westernblot技術(shù)檢測原代培養(yǎng)的鼻咽癌細胞中CCNG和SPARC的表達,結(jié)果顯示在原代培養(yǎng)的鼻咽癌中CCNG1和SPARC蛋白高表達(圖5),提示在鼻咽癌中miR203可能調(diào)控一系列基因表達包括CCNG1和SPARC基因。3mirn-203、mir-33e、mir-133a的基因組織近年來,miRNAs作為生物體重要的基因調(diào)控分子,與疾病的關(guān)系尤其是與腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注。隨著miRNA芯片技術(shù)的發(fā)展,現(xiàn)已明確在多種腫瘤中存在miRNAs的異常表達或缺失,推斷miRNAs很可能是一類新的癌基因或抑癌基因。有研究者運用miRNAs芯片對慢性淋巴細胞白血病(chroniclymphocyticleukemia,CLL)的研究發(fā)現(xiàn)2個miRNAs的基因,即mir-15a和mir-16,位于13q14染色體缺失區(qū)域,50%~60%的CLL的患者存在mir-16和/或mir-15a的表達下調(diào),miR-143和miR-145在結(jié)腸癌中表達下調(diào),Let-7在肺癌細胞中表達下調(diào),在A549肺腺癌細胞中轉(zhuǎn)染并表達Let-7,導(dǎo)致腫瘤細胞生長抑制,這些均提示miRNAs已經(jīng)成為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的一個新領(lǐng)域。目前miRNAs在鼻咽癌中的研究尚未見報道,我們以miRNAs芯片為平臺初步研究了鼻咽癌miRNAs表達譜,發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的鼻咽癌細胞與正常鼻咽上皮細胞的之間存在24個差異表達miRNAs,其中18個miRNA在鼻咽癌中表達下調(diào),6個miRNA在鼻咽癌表達上調(diào)。在鼻咽癌表達下調(diào)2倍以上的有:miR-203、miR-503、miR-424、miR-141和miR-148a共5個;在鼻咽癌表達上調(diào)2倍以上的有:miR-25、miR-195和miR-15a共3個。Irio等用基因芯片研究了乳腺癌的miRNA,共發(fā)現(xiàn)了29個明顯的差異表達的miRNA,其中miR-10b,miR125b,miR-145是下調(diào)的,而miR-21,miR-155是上調(diào)的,推測他們可能分別做為腫瘤的抑癌基因和原癌基因。結(jié)合生物信息學(xué)的方法,使miRNA功能的研究更簡單,而且有可能開辟一條新的研究路線,逐一找到miRNA的靶基因并揭示他們的功能。研究人員設(shè)計了多種計算機軟件,對miRNA靶基因預(yù)測具有較高的準確性,應(yīng)用Pictar,tangetscan,miRanda,mirBase等miRNA預(yù)測軟件,對前面實驗得出的鼻咽癌細胞下調(diào)表達的miR-203的靶基因進行檢索和研究。我們選取至少在三個軟件中出現(xiàn)的基因作為miR-203的靶基因,發(fā)現(xiàn)其靶點非常廣泛,涉及到癌基因,細胞周期調(diào)控,細胞分化,轉(zhuǎn)錄調(diào)控,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因等46個潛在可能的靶基因。結(jié)合本組鼻咽癌細胞人類全基因表達譜結(jié)果(未發(fā)表資料),其中有5個基因為上調(diào)表達,它們是:SPARC,CCNG1,ID2,INSIG1和CITED2,有3個基因表現(xiàn)為下調(diào)表達,其余基因無明顯變化或者無數(shù)據(jù)。在表達上調(diào)的5個靶基因中,我們挑選SPARC和CCNG1來進行蛋白水平的驗證,結(jié)果表明相對于正常鼻咽上皮細胞,SPARC和CCNG1在鼻咽癌細胞中是高表達的,由此我們認為SPARC和CCNG1可能是miR-203的靶基因之一。較早期時研究者認為miRNA是與靶mRNA形成不完全互補雙鏈來阻遏翻譯。然而Wu等的研究則表明其調(diào)節(jié)基因表達機制不盡如此。他們認為miRNA除了阻遏翻譯外,還可引起mRNA快速脫腺苷酸化而被降解以抑制基因表達。這種對miRNA的研究在理論上豐富了我們對miRNA基因調(diào)控的認識。CyclinG1參與DNA損傷后檢查點調(diào)控、DNA修復(fù)和凋亡,細胞增生,并且在很多細胞增生活躍的組織/病變中都可以看到CyclinG1的過度表達。CyclinG1可以和GAK,CDK5,pRb相互作用參與多種凋亡通路。分泌性富含半胱氨酸的酸性蛋白(secretedprotienacidicandrichincysteine,SPARC)又稱作骨連接蛋白(osteonectin),編碼基因位于染色體5q31-33。SPARC作為一種調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的糖蛋白,又是抗粘附蛋白,與某些基質(zhì)成份、生長因子和細胞因子作用,參與組織重建、形態(tài)生成、細胞遷移和增殖,調(diào)節(jié)機體的生理和病理過程。近來發(fā)現(xiàn)SPARC在多種腫瘤中表達異常,尤其是有證據(jù)表明SPARC異常表達與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,抑制腫瘤細胞SPARC的表達,不但可以減少體外黑色素瘤腫瘤細胞的侵襲和粘附能力,而且還可完全遏制其致瘤能力。近年來,SPARC在腫瘤內(nèi)皮的表達被確定,被論證為與MMP-2和腫瘤生長因子-β相似的調(diào)節(jié)血管生成的相關(guān)基因。綜上所述,本研究首次以miRNAs芯片技術(shù),對鼻咽癌miRNAs表達譜進行研究,發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞