病理方法學(xué)概要

病理方法學(xué)陳鶴病理組織學(xué)常用制備技術(shù)一、組織的固定

應(yīng)用各種方法使病理標(biāo)本盡量保持其離體前狀態(tài)的過(guò)程稱為固定（fixation）。

固定的目的和機(jī)制是：①使蛋白質(zhì)凝固，終止或減少分解酶的作用，防止自溶，保存組織、細(xì)胞的離體前結(jié)構(gòu)狀態(tài)，包括保存組織或細(xì)胞的抗原性，使抗原不失活，不發(fā)生彌

散。②保存組織、細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖原、某些維生素及病理性蓄積物，維持病變的特異性特征。③使上述物質(zhì)轉(zhuǎn)為不溶解狀態(tài)，防止和盡量減少制片過(guò)程中人為的溶解和丟失。④起助染作用。

固定方法有：①物理學(xué)方法，如低溫冷凍，干冰（dry

ice，即固態(tài)無(wú)水碳酸）冰凍真空脫水，石蠟滲入法。

②化學(xué)方法，采用各種化學(xué)溶液作固定液，使組織細(xì)胞進(jìn)入固定狀態(tài)。這是國(guó)內(nèi)最常

用的方法。固定注意事項(xiàng)

固定應(yīng)在標(biāo)本離體后盡快進(jìn)行，小標(biāo)本可在取材后直接放入固定液內(nèi)，大標(biāo)本應(yīng)在手術(shù)結(jié)束前或結(jié)束后迅速放入固定液內(nèi)。

固定液與標(biāo)本的比例不得少于標(biāo)本體積得5倍。有特殊要求者應(yīng)事先選定相應(yīng)得固定液，如欲查糖原，應(yīng)選擇無(wú)水乙醇作固定液等。

固定得時(shí)間應(yīng)適當(dāng)，微小標(biāo)本（如胃粘膜等）2～4h即可，大標(biāo)本應(yīng)置放12～24h，但亦不要過(guò)久，以免影響抗原性，造成免疫組化操作中得困難。（二）常用固定液及其配制固定液分單純固定液和混合固定液。甲醛（formaldehyde）

是無(wú)色氣體，易溶于水成為甲醛溶液。易揮發(fā)，且有強(qiáng)烈刺激氣味，常用得是37％～40％甲醛溶液，商品名為福爾馬林（formalin）。用作固定的濃度習(xí)慣為10％福爾馬林（即1份福爾馬林溶液加9份水配制而成），實(shí)際含甲醛4％。

10％福爾馬林滲透力強(qiáng)，固定均勻，對(duì)組織收縮少。對(duì)脂肪、神經(jīng)及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定劑。

經(jīng)福爾馬林固定時(shí)間長(zhǎng)的組織，易產(chǎn)生黑色的沉淀，稱福爾馬林色素。乙醇

無(wú)色液體，易溶于水，它除可作為固定劑外，還可作為脫水劑，對(duì)組織有硬化作用。固定用一般是80%~95%濃度，乙醇滲透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的著色不良。中性甲醛液（混合固定液）

甲醛（濃）120ml，加蒸餾水880ml,磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）4g，磷酸氫二納（Na2HPO4）13g。此液固定效果比單純10％福爾馬林要好。4%多聚甲醛固定液固定液配方：40g多聚甲醛，溶于1000ml，0.1mol/L的PB液，不容易溶解，放于密封瓶中，60℃溫箱過(guò)夜即可溶解，也可以加溫至60℃，攪拌溶解。AF液（混合固定液）

95％乙醇90ml，甲醛(濃)10ml。也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（濃）10ml，冰醋酸5ml。

此液除有固定作用外，兼有脫水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脫水。

以上4種固定液中，以中性甲醛為首選，其次為10％福爾馬林，乙醇應(yīng)盡量不用。常規(guī)石蠟切片操作（一） 組織洗滌洗滌（washing），目的：清除組織內(nèi)外殘留的固定劑；防止有些固定劑在組織中發(fā)生沉淀或結(jié)晶而影響觀察。洗滌方式：底入上出，時(shí)間2h-24h。組織脫水

為保證石蠟有可能進(jìn)入組織內(nèi)部，采用適當(dāng)方法，將已固定和水洗過(guò)的組織中的水分徹底驅(qū)除的過(guò)程稱為脫水。脫水劑必須是與水在任何比例均能混合的液體。最常用的脫水劑為乙醇，其它尚有正丁醇和二氧已環(huán)以及丙酮等。濃度與時(shí)間脫水用的乙醇濃度一般從70％-75％開(kāi)始，然后依次80％→95％→100％，即由低濃度逐步到高濃度。脫水的時(shí)間與組織大小組織脫水時(shí)間在低濃度乙醇中可以長(zhǎng)些（如70％-80％），而在高濃度乙醇中要短。組織透明采用既能與脫水劑（如乙醇）混合，并使之被除去又能作為石蠟溶媒的誘導(dǎo)劑，使石蠟真正滲入組織中的過(guò)程。因此，通常又稱此過(guò)程為透明（clearing）。常用的透明劑為二甲苯，它易使組織收縮、變脆，故透明時(shí)間不宜長(zhǎng)，一般1.5-2h，二節(jié)（即換2次，下同），最好是肉眼觀察，見(jiàn)組織呈棕黃色或暗紅色透明狀（象琥珀樣）即可。（四）組織浸蠟組織經(jīng)媒介（透明）處理后，置入熔化的石蠟內(nèi)浸漬，使石蠟分子浸透入組織中的過(guò)程稱浸蠟或石蠟透（infiltrating）。 透的過(guò)程也可用火棉膠代替石蠟，稱為浸膠。但其透明過(guò)程應(yīng)作相應(yīng)改動(dòng)。浸蠟一般分2-3節(jié)，總共4-24h，浸蠟時(shí)間過(guò)短，蠟沒(méi)有完全入組織中，組織過(guò)軟，切片困難；浸蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成組織硬脆，切片也困難。注意事項(xiàng)（1）包埋框要比組織塊大，這樣保證包成的蠟塊組織四周都有蠟邊。（2)胃、腸、膽囊等組織，應(yīng)將能看到組織學(xué)各個(gè)層面的一面作為切面。其它組織應(yīng)將切面朝下。包埋蠟冬季用低熔點(diǎn)（56-58℃），夏秋季用高熔點(diǎn)蠟（60-62℃）。包埋蠟最好是經(jīng)多次熔化、沉淀過(guò)的蠟，這樣的蠟干凈、致密，利于切片。Masson染色Masson復(fù)合染色液的配制：酸性復(fù)紅1

g麗春紅2

g橘黃G

2

g0.25%醋酸300

ml混勻，過(guò)濾后備用。

亮綠染色液的配制：亮綠干粉0.1

g0.2%醋酸100

ml充分混勻，過(guò)濾后備用。Masson染色

（1）常規(guī)脫蠟至水：二甲苯Ⅰ10

min→二甲苯Ⅱ10

min→100%酒精Ⅰ5

min→100%酒精Ⅱ5

min→95％酒精3

min→90％酒精3

min→80％酒精3

min→70％酒精3

min→蒸餾水1

min（2）Masson染色：Masson復(fù)合液5

min→自來(lái)水過(guò)洗2次→0.2%醋酸Ⅰ1

min→0.2%醋酸Ⅱ1

min→自來(lái)水過(guò)洗1次→1%磷鎢酸6

min→自來(lái)水過(guò)洗1次→亮綠15min→自來(lái)水過(guò)洗2次→0.2%醋酸Ⅰ1min→0.2%醋酸Ⅱ1min→自來(lái)水過(guò)洗1次

（3）常規(guī)脫水透明：70%酒精30

s→80％酒精30

s→90%酒精30

s→95％酒精30

s→100%酒精Ⅰ5

min→100%酒精Ⅱ5

min→二甲苯Ⅰ5

min→二甲苯Ⅱ10

min→中性樹(shù)膠封片石蠟標(biāo)本中RNA的提取

在實(shí)際臨床病理診斷和病理回顧性研究中，來(lái)源最豐富、最容易獲得的是經(jīng)過(guò)石蠟包埋保存的檔案組織。與DNA相比較，RNA很不穩(wěn)定，容易受到環(huán)境溫度、酸堿度等因素的影響，尤其是無(wú)處不在的RNA酶對(duì)它的降解破壞，使得長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)RNA的研究材料都僅限于培養(yǎng)細(xì)胞或新鮮組織，至少是冰凍組織，影響了對(duì)它的研究應(yīng)用。

以石蠟包埋組織為研究材料，在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，對(duì)石蠟組織RN

A的提取方法進(jìn)行改進(jìn)和完善，擬建立一套在石蠟包埋組織中提取RN

A的有效方法。方

法實(shí)驗(yàn)用品RNA酶的滅活玻璃器皿（量筒、燒杯、試劑瓶、玻片等)常規(guī)清洗浸泡后，用錫箔紙密封瓶口，置于180℃烤箱中烘烤8h塑料用品(tip頭、tip頭盒、離心管.PCR管等)置于0.1的DEPC溶液中浸泡12h后高壓消毒(121℃，22min)，烤干備用。RNA提?。?）切片:切片機(jī)用75%乙醇充分擦凈，之后用

0.1%的

DEPC充分清洗。用0.1%的DEPC擦拭的一次性刀片切5um厚石蠟切片5-10張(根據(jù)組織大小調(diào)整)，置于經(jīng)RNA酶滅活處理的1.5ml,離心管中。腫瘤組織需將切片裱于RN

A酶滅活處理的玻片上，經(jīng)H

E切片觀察定位后，再刮取腫瘤區(qū)域裝管;脫蠟:加入1.2m1二甲苯，室溫。離心，8600

r/min

10

min,離心3次。若脫蠟仍

不理想則將EP管置于37℃孵箱15-20

min,再以上述轉(zhuǎn)速離心8min.清洗:加入無(wú)水乙醇1.2ml室溫.離心，

8600

r/min,

10min,離心3次。干燥:棄出管中酒精，開(kāi)蓋，置T-37℃孵 箱，20min。(

5

)消化:加入組織裂解緩沖液(20

mmo1/LTris,

pH

8.0, 20

mmo1/LEDTA,pH

8.0%SDS,

pH

7.2)

200

-

250

vl混勻，加入蛋白酶K(終濃度400mg/L),置于58℃烤箱或水浴振蕩搖床進(jìn)行組織消化至液體清亮。消化時(shí) 間根據(jù)組織類型而定;(6)滅活蛋白酶K:將消化后的組織置于95℃水浴鍋，水浴lOmin,試劑，混勻，室溫孵育(7)加入TRIZOL10min加入氯仿

200

ul

用力震蕩后靜置3min,4℃, 13000

r/min 離心15min吸取上層水相，加入等體積異丙醇，混勻，置于一20C沉淀RNA,2h。4℃,

13

000 r/min

離心15min;棄上清，加入1.2ml75%的酒精(0.1%DEPC處理水配制)，離心，4C，11000r/min,10

min棄上清，倒置懸空離心管，干燥8

min加入0.1%的DEPC處理水，58℃，10min以溶解RNA。對(duì)上述方法提取的RNA質(zhì)量不理想者，進(jìn)行從步驟(5)一(12)的二次提取，每步根據(jù)具體情況酌情縮短時(shí)間。合格的RNA保存于85℃超低溫冰箱備用。經(jīng)典DNA提取法將石蠟包埋組織切成3vm-5

Nm厚.共5張一7張置Eppendoff管中加二甲苯混勻.脫蠟一次離心棄上清加無(wú)水乙醉脫二甲苯2次.離心棄上清，干燥沉淀加含蛋白酶K裂解液置于37℃恒溫水浴過(guò)夜

(5)Tris飽和酚.氯仿抽提二次快速DNA提取法(1)一(3)同經(jīng)典方法(4)加含蛋自酶K裂解液.置于37℃恒溫水浴3h.95℃加熱10

min,1

400

r/min.5

min(5)取5 L擴(kuò)增或一20℃凍存固定劑和固定時(shí)間對(duì)石蠟包埋組織檢測(cè)病毒RNA的影響研究結(jié)果顯示固定時(shí)間短、擴(kuò)增片段短擴(kuò)增效果好。同一種固定方式擴(kuò)增片段越長(zhǎng)，擴(kuò)增的穩(wěn)定性越差;同一固定劑固定時(shí)間越短，RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果越穩(wěn)定;采用同一固定時(shí)間從甲醇、乙醇及丙酮等沉淀類固定劑固定后石蠟包埋的病毒組織中擴(kuò)增出病毒RNA的陽(yáng)性結(jié)果比醛類固定后包埋組織高，RT-PCR擴(kuò)增長(zhǎng)片段的穩(wěn)定性高。甲醇等沉淀類固定劑固定標(biāo)木時(shí)組織未產(chǎn)生廣泛的交聯(lián)效 應(yīng)，所以進(jìn)行核酸分離過(guò)程中斷裂的機(jī)遇比醛類固定劑少， 也因此可保存相對(duì)高分子量的核酸。但在固定過(guò)程中固定劑不能將組織中RNAases破壞徹底，所以固定時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)RNA破壞效應(yīng)越大。不同的固定劑木身與RNA或蛋白所起反應(yīng)速度、反應(yīng)結(jié)果不一致。免疫組化常見(jiàn)問(wèn)題陳

鶴1、石蠟切片和冰凍切片的比較？試劑要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一

步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)

構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；（3）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80℃度的低溫冰箱中，尤其是用來(lái)做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。2、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？單克隆和多克隆抗體的選擇在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗原靈敏度相對(duì)就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過(guò)封閉等避免）。應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western

blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。種屬反應(yīng)性的選擇（species

reactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測(cè)哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。種屬來(lái)源。一般兔來(lái)源的多是多克??；而小鼠來(lái)源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來(lái)源來(lái)選擇相應(yīng)的二抗。生產(chǎn)廠家的選擇。如santa

Cruz公司抗體一般1ml，價(jià)格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，價(jià)格2800元左右。3、在什么情況下使用Triton-X100？TritonX-100化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)(>10um厚切片)和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton

X-100作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。其作用原理：TritonX-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和

胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能

順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。（3)Triton

X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用4、封閉血清的選擇原則是什么？膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗 體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會(huì)造成背景。也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。5、抗體孵育條件的比較？一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37℃度，其中4℃效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過(guò)夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。二抗一般室溫或37℃30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。6、一抗4度孵育后為什么要進(jìn)行37度復(fù)溫？一方面，防止切片從4℃直接放入PBS易脫片；另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用,4℃和37℃時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。7、DAB顯色時(shí)間如何把握？DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短（最好一抗4度過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。8、免疫組化結(jié)果如何分析？陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，每組3-6張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。灰密度分析法。通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用軟件進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。（3）評(píng)分法。通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（0-3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分（1-4分為0-25%、26-50%、51-75%、76-100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。對(duì)于以上這幾種方法，各有利弊，請(qǐng)細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。9、在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗

原檢測(cè)率。修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。微波修復(fù)，我們一般用6min*4次，效果不錯(cuò)。10、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？一般3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右；而

0.3%過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般10-30min。用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片?，F(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。10、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？一般3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右；而0.3%過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般

10-30min。用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片?，F(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4℃避光保存。11、如何才能充分脫蠟？蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起染色不均勻、陽(yáng)性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問(wèn)題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短；脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長(zhǎng)，10-20分鐘或更長(zhǎng)。（3）當(dāng)天切的切片，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過(guò)程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果更好。總之，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來(lái)決定，脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。12、如何最大限度地降低組織非特異性染色？縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái) 源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng) 封閉效果；縮短DAB孵育時(shí)間或降低DAB濃度/過(guò)氧化氫濃度等；適當(dāng)增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；防止標(biāo)本染色過(guò)程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。13、蘇木素復(fù)染時(shí)間的把握？蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。不過(guò)這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。即：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭，作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動(dòng)作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。如果分化的顏色過(guò)淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。14、PBS的清洗方式選擇、次數(shù)和時(shí)間的選擇？單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。臨床上每天檢測(cè)的病例很多，所用的抗體種類及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們?cè)谝粋€(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會(huì)造成交叉污染，影響最后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒(méi)有相互交叉污染的機(jī)會(huì)。溫柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來(lái)，不要拿起切片將PBS對(duì)準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導(dǎo)致切片的脫落。（3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。切片用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無(wú)需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。（4）PBS的pH和離子強(qiáng)度的使用和要求。中性及弱鹼性條件（pH7－8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而

高離子強(qiáng)度則有利于分解。免疫組化我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，使用效果好。（5）常用試劑的配制和使用。在免疫組織化學(xué)的染色過(guò)程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開(kāi)緩沖液?？梢?jiàn)緩沖液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過(guò)酸或偏堿，都將影響染色的結(jié)果。15、脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片？多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問(wèn)題。組織切的不好，切片機(jī)的問(wèn)題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。組織的問(wèn)題，腦組織最容易脫片。沒(méi)烤好，時(shí)間短溫度不夠之類。操作的時(shí)候甩的太猛，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。修復(fù)的問(wèn)題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)了，或動(dòng)做粗暴。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片。16、背景染色較深的原因有哪些？抗體濃度過(guò)高：一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書進(jìn)行染色。抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下，過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用，這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。

DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反

應(yīng)。組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用記號(hào)筆在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4oC冰箱過(guò)夜，對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過(guò)期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時(shí)最好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過(guò)的抗體作比較。17、蘇木素復(fù)染后氨水返藍(lán)這一步如何做、濃度多少、時(shí)間多長(zhǎng)?返藍(lán)可以用堿性溶液（PBS/Na2HPO4/淡氨水）或45度溫水、冷水藍(lán)化均可。一般藍(lán)化5-10

min。淡氨水有人用50ml自來(lái)水加三四滴的氫氧化銨。腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的實(shí)驗(yàn)技術(shù)陳

鶴細(xì)胞侵襲試驗(yàn)基質(zhì)膠準(zhǔn)備：將凍存于-20度冰箱的BD

matrigel

4度過(guò)夜，變成液態(tài)。在冰上將化好的matrigel用無(wú)血清的培液按照1：10稀釋，混勻，然后加入100μl到transwell小室，37度孵育8小時(shí)。消化細(xì)胞，用無(wú)血清的培液重懸細(xì)胞并稀釋到10的6次方個(gè)cells/ml。吸棄小室中的matrigel,用無(wú)血清的培液洗一次，加入100μl的細(xì)胞懸液并加入相應(yīng)濃度的藥物和DMSO。細(xì)胞侵襲試驗(yàn)5．下室加入600

μl的有血清的培液，并加入相應(yīng)濃度的藥物和DMSO。6．37度孵育16小時(shí)。7．90%乙醇固定30分鐘。8．PBS洗兩次，0.2%結(jié)晶紫染色30分鐘，PBS洗兩次，用酒精棉球擦去上表面的細(xì)胞，顯微鏡下拍照。9．10%乙酸抽提20分鐘，酶標(biāo)儀600

nm測(cè)OD值。10.抑制率（%）=(OD對(duì)照孔-OD給藥孔)/OD對(duì)照孔×100%。TranswellTranswell：trans-這個(gè)詞根有轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運(yùn)、穿過(guò)等意思，well有小室的意思，可以從字面上理解，這是一類有通透性的杯狀的裝置，根據(jù)

Corning公司的Transwell說(shuō)明書中的介紹，可以認(rèn)為這是一種膜濾器（Membrane

filters），也可認(rèn)為是一種有通透性的支架（permeablesupports）。

杯子底層的一張有通透性的膜，而杯子其余部分的材料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.1--12.0μm，根據(jù)不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate

membrane）。

將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。（1）共培養(yǎng)體系：小于3.0um孔徑條件下，細(xì)胞不會(huì)遷徙通過(guò)，因此，若研究不涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，不需要細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜，則應(yīng)選擇3.0μm以下孔徑。常用0.4、3.0μm。將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的影響。1．Transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)過(guò)程與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)基本一致，不同的只是不需要鋪Matrigel。個(gè)人認(rèn)為，由于沒(méi)有基質(zhì)膠的阻擋，細(xì)胞穿過(guò)膜的速度較侵襲實(shí)驗(yàn)明顯加快，所以細(xì)胞量要更大。我做侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞密度是1×105，而遷移實(shí)驗(yàn)的密度是1×106。另外，下層培養(yǎng)液的FBS濃度也可適當(dāng)下調(diào)，我做侵襲實(shí)驗(yàn)的濃度是5%，遷移實(shí)驗(yàn)的濃度是2.5%。2．Transwell上皮細(xì)胞培養(yǎng)步驟將雄性wistar大鼠麻醉，開(kāi)胸，將氣管取出，置于4℃含

0.1％胰蛋白酶XIV(Sigma)，100

U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素（Gibco-BRL）、無(wú)Ca2＋、Mg2＋，無(wú)血清的MEM。用無(wú)菌的細(xì)胞刮棒刮氣管內(nèi)壁，將所得溶液離心后得到游離細(xì)胞。離心后立即用新鮮的上述MEM溶液（含10%胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素和100

ug/ml鏈霉素的LHC-8

medium(Biofluids)沖洗一次。沖洗過(guò)后，將得到的細(xì)胞懸液用臺(tái)盼蘭測(cè)定活力，若存活率大于90%，則將細(xì)胞以106/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾膜上（12

mmSNAPWELL,Costar），以37°C

5%CO2-95%空氣含5%胎牛血清(Gibco-BRL)and

100

U/ml青霉素and

100ug/ml鏈霉素的LHC-8medium孵育6-10天。(5)孵育后，經(jīng)測(cè)定跨上皮電阻在1000-2000Ω之間，即可用于電生理試驗(yàn)。顯微鏡下氣管上皮細(xì)胞形細(xì)胞呈鋪路石狀，圓形核位于中央，生長(zhǎng)時(shí)常彼此緊密連接成單層細(xì)胞片3.Transwell

B16細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)

首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8

um）的下表

面涂一層fibronectin(10

ug/ml，50ul),37度2小時(shí)，PBS洗一遍后，放入預(yù)先每孔加有600ul的培養(yǎng)基（含10%血清）的24孔板內(nèi)，后在

Transwell的內(nèi)室加入細(xì)胞（100ul,用含0.1%血清的培養(yǎng)基稀釋好自己所需密度），放入培養(yǎng)箱，12-18小時(shí)后，取出Transwell，用棉簽擦

去PVPF膜靠近內(nèi)室那一面的細(xì)胞，另一面的細(xì)胞用甲醛室溫固定30分鐘，結(jié)晶紫染色20分鐘，用清水洗3遍以上，后在顯微鏡下觀察細(xì)胞，記數(shù)。4．內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1遷移實(shí)驗(yàn)

1%明膠處理的transwell經(jīng)無(wú)血清的MCDB131培液于培養(yǎng)箱中平衡1小時(shí)后，上室加入100μl用serum-free

MCDB131稀釋的5*104/