佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型免疫病理特征及發(fā)病機理

佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型免疫病理特征及發(fā)病機理

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（ra）是一種常見的自身免疫性疾病，嚴(yán)重危害人類健康。病因不明確，病理復(fù)雜多樣。目前，臨床上沒有理想的治療方法，這是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點之一。佐劑性關(guān)節(jié)炎(AdjuvantArthritis,AA)大鼠是研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)及評價防治RA藥物的常用動物模型之一,其病理表現(xiàn)與RA有一定的相似之處,如病變關(guān)節(jié)腫脹,細(xì)胞免疫功能異常等,但其免疫病理特征及發(fā)病機制目前仍不十分清楚。因此,闡明其免疫病理特征及發(fā)病機理,對于更為恰當(dāng)?shù)貞?yīng)用該模型具有重要實際意義。本文對AA大鼠的免疫功能變化及其發(fā)生機制進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1實驗動物Wistar大鼠,雄性,160～200g,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。1.2豬鼠血清因子t細(xì)胞刀豆蛋白A(ConA),Sigma公司;卡介苗,衛(wèi)生部生物制品檢定所;RPMI-1640培養(yǎng)基,Gibco公司;新生小牛血清(NCS),本院放射醫(yī)學(xué)研究所;3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR),中國原子能研究院同位素研究室;補體,為豚鼠血清。成年豚鼠,股動脈取血,離心,獲得新鮮豚鼠血清,-80℃保存;美洲商陸(PWM),Sigma公司。小鼠抗大鼠T細(xì)胞分化抗原單克隆抗體(進(jìn)口分裝),熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體,邦定生物醫(yī)學(xué)公司;辣根過氧化酶標(biāo)記兔抗大鼠抗體,兔抗大鼠IgG抗體,純化兔IgG抗體,本院微生物與流行病研究所。1.3低溫常速離心檢測二氧化碳孵溫箱,日本池本理化株式會社;液體閃爍計數(shù)儀,LKB公司;HITACHI20PR-5型低溫常速離心機,日本日立公司;高速離心機,本院儀器廠;MCC/340型酶標(biāo)儀,美國FLOW公司;XHF-1型高速分散器,上海興華電子儀器廠。1.4方法1.4.1致炎側(cè)關(guān)節(jié)水腫參見文獻(xiàn),取羊毛脂與石蠟油(1:2),加熱混勻,高壓滅菌后4℃保存,使用時加入卡介苗(10mg/ml),配制成弗氏完全佐劑(CFA),大鼠右足墊皮內(nèi)注射(0.05ml/只)致敏大鼠,原發(fā)病變表現(xiàn)為致炎側(cè)的關(guān)節(jié)腫脹,致敏后即可出現(xiàn),繼發(fā)病變一般于致炎12～14d后出現(xiàn),表現(xiàn)為非致炎側(cè)及雙前肢的關(guān)節(jié)腫脹。1.4.2實驗結(jié)果實驗前4天動物以綿羊紅細(xì)胞(SRBC)致敏(ip,5×109/只],實驗時斷頭取脾,制備1.5×106ml-1的細(xì)胞懸液,并加入適量綿羊紅細(xì)胞及補體,取混合液灌入玻片小室,37℃溫育1h,計數(shù)小室內(nèi)溶血空斑數(shù),結(jié)果以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示。1.4.3細(xì)胞cpm測定參見文獻(xiàn),動物斷頭取脾,制備5×106ml-1的細(xì)胞懸液,取0.1ml懸液與等體積1640液或ConA(終濃度為2.5μg/ml)加入96孔培養(yǎng)板內(nèi),二氧化碳孵溫箱溫育54h,加入[3H]TdR,繼續(xù)培養(yǎng)至72h后用多頭細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞,80℃烘干后液體閃爍計數(shù)儀測cpm值。1.4.4脾細(xì)胞懸液的制備以抗體生成反應(yīng)為指標(biāo),觀察大鼠脾細(xì)胞抑制活性。以SRBC致敏大鼠,4d后斷頭取脾,制備2.5×106ml-1的細(xì)胞懸液,為指示細(xì)胞(A)。另取未致敏對照組(B)及AA組(C)大鼠同法制備脾細(xì)胞懸液,為待測細(xì)胞。實驗共設(shè)置3個組,分別為空白對照組(A組脾細(xì)胞+等容積培養(yǎng)液),對照組(A組脾細(xì)胞+B組脾細(xì)胞),實驗組(A組脾細(xì)胞+C組脾細(xì)胞),B及C組脾細(xì)胞均為2.5×106ml-1。然后按溶血空斑實驗方法檢測抗體生成反應(yīng),結(jié)果以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示。1.4.5羊抗大鼠與大鼠的酶聯(lián)免疫檢測參照文獻(xiàn)應(yīng)用ELISA法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IgG水平。取AA及正常大鼠,無菌取脾,制細(xì)胞懸液,用Tris-NH3Cl去除紅細(xì)胞,調(diào)整濃度為2.5×106ml-1,另配制80μgml-1的美洲商陸,各取0.1ml加入96孔板內(nèi),于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)7d后,離心收集上清,-20℃保存?zhèn)溆?。實驗時用羊抗大鼠IgG包被聚苯乙烯板,依次加入0.05ml脾細(xì)胞培養(yǎng)上清、0.1ml羊抗大鼠酶標(biāo)抗體,反應(yīng)后加入底物,在酶聯(lián)免疫檢測儀測定光密度,結(jié)果用酶標(biāo)指數(shù)(EnzymeIndex,EI)表示。EΙ=被測組血清ΟD值對照組血清ΟD值+3s×100EI=被測組血清OD值對照組血清OD值+3s×1001.4.6elisa檢測取純化兔IgG溶于PBS液中,63℃熱變性20min,加入0.36mol/L的Na2SO4鹽溶液沉淀,10000r/min離心20min,棄上清,取沉淀溶于包被液中(20μg/ml),包被聚苯乙烯板4℃過夜,檢測待測血清中RF因子水平,ELISA實驗方法同前,結(jié)果以酶標(biāo)指數(shù)(EnzymeIndex,EI)表示。EΙ=被測組血清ΟD值對照組血清ΟD值+3s×100EI=被測組血清OD值對照組血清OD值+3s×1001.4.7亞組細(xì)胞的檢測應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FACS)參照文獻(xiàn)進(jìn)行。1.4.8ctrtgaagctagctagctagct基因回復(fù)突變tga應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測脾細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平。參照文獻(xiàn)方法,選用β-actin為外標(biāo),在β-actin、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-gamma序列的5′、3′分別設(shè)計上下游引物,β-actin:5′ctatcggcaatgagcggttc3′,5′cttaggagttgggggtggct3′;IL-25′gcgcacccacttcaagccct3′,5′ccaccacagttgctggctca3′;IL-4:5′atgcaccgagatgtttgtacc3′,5′tttcagtgttctgagcgtgga3′;IL-10:5′tgccttcatcaagtgaagact3′,5′aaactcattcatggccttgta3′;IFN-gamma,5′ccctctctggctgttactgc3′,5′ctccttttccgcttccttag3′?？俁NA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR、電泳實驗參見文獻(xiàn)進(jìn)行。1.4.9統(tǒng)計處理所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)(xˉ±s)表示,組間差異采用t檢驗分析判定。2結(jié)果2.1關(guān)節(jié)水腫度AA大鼠于致敏后第22天用容積法測量踝關(guān)節(jié)腫脹度。結(jié)果表明,致敏側(cè)即原發(fā)病變側(cè)和對側(cè)即繼發(fā)性病變側(cè)的后肢踝關(guān)節(jié)與正常對照組相比均發(fā)生了明顯腫脹,結(jié)果見表1。2.2aa大鼠脾細(xì)胞對srbc誘導(dǎo)抗體生成的反應(yīng)能力AA大鼠于致敏后22d檢測脾細(xì)胞抗體生成反應(yīng)。結(jié)果如圖1所示,AA大鼠脾細(xì)胞對SRBC誘導(dǎo)的抗體生成反應(yīng)能力較對照組明顯增強,溶血空斑(PFC)數(shù)明顯增加(圖1)。2.3這是由于coa如圖2所示,AA大鼠于致敏后22天,其脾細(xì)胞對ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)能力較對照組顯著降低(圖2)。2.4對aa大鼠的術(shù)后誘導(dǎo)igg表達(dá)的影響AA大鼠于致敏后第22d進(jìn)行實驗。結(jié)果表明AA大鼠的脾細(xì)胞對PWM誘導(dǎo)的IgG產(chǎn)生與對照組大鼠相比略有升高,但無統(tǒng)計學(xué)差異(實驗數(shù)據(jù)未列出)。2.5血清rf因子水平AA大鼠于致敏后22d用ELISA法檢測血清RF因子水平。結(jié)果表明,與對照組相比,AA大鼠血清RF水平無明顯變化(實驗數(shù)據(jù)未列出)。2.6兩組大鼠脾抑制活性結(jié)果如表2所示。正常脾細(xì)胞具有一定的抑制活性,表現(xiàn)為PFC數(shù)目較空白對照組減少,AA大鼠脾的抑制活性明顯降低,PFC數(shù)較對照組明顯增加。2.7t細(xì)胞亞群檢測AA大鼠于致敏后22d取脾臟制備脾細(xì)胞懸液,用抗體標(biāo)記后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞亞群。結(jié)果表明,與對照組相比,AA大鼠的CD8+細(xì)胞比例明顯增高,CD4+細(xì)胞有降低的趨勢,但與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(表3)。2.8n、il-4、-actin的凝膠電泳圖大鼠于致敏后22d提取脾細(xì)胞總RNA,應(yīng)用RT-PCR法檢測細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。圖3為IL-10、IFN-γ、β-actin的反轉(zhuǎn)錄-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖,圖4為IL-2、IL-4、β-actin的反轉(zhuǎn)錄-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖,對凝膠電泳圖進(jìn)行圖象分析的結(jié)果見表4。結(jié)果表明,AA大鼠IL-10/β-actin、IFN-γ/β-actin、IL-4/β-actin的比值明顯低于對照組,提示AA大鼠的IL-10、IFN-γ、IL-4mRNA表達(dá)水平降低,IL-2mRNA水平則較正常對照組明顯增高。3對aa大鼠的病理表現(xiàn)進(jìn)行了探討,但同時表現(xiàn)其病理理變化本研究結(jié)果表明,AA大鼠于致敏后發(fā)生雙側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)明顯腫脹,致敏側(cè)踝關(guān)節(jié)系炎性腫脹而致敏對側(cè)則為繼發(fā)性自身免疫性腫脹,與報道的實驗結(jié)果相一致,提示AA大鼠與RA病人在關(guān)節(jié)腫脹方面具有相似性。對AA大鼠的免疫功能研究發(fā)現(xiàn),AA大鼠脾細(xì)胞對SRBC誘導(dǎo)的抗體生成反應(yīng)明顯增強,表明AA大鼠的特異性抗體應(yīng)答反應(yīng)增強,但其脾細(xì)胞對PWM誘導(dǎo)的IgG產(chǎn)生并無明顯增加,血清RF的水平與對照組相比也沒有明顯增高,提示AA大鼠的B細(xì)胞功能無明顯異常變化。而大多數(shù)RA病人均出現(xiàn)RF水平增高的現(xiàn)象,在這一方面,AA大鼠與RA病人不同。AA大鼠對ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)能力較對照組明顯減弱,提示其T細(xì)胞功能異常,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其脾細(xì)胞抑制活性降低,提示AA大鼠的Ts細(xì)胞功能下降,但AA大鼠外周血CD8+細(xì)胞比例明顯升高。其可能機理有3個方面,一是Ts功能下降所引起的代償性反應(yīng);二是殺傷性T細(xì)胞(Tc)的數(shù)量增加;三是,已有研究表明,存在CD8+的輔助T細(xì)胞,因此,在AA大鼠也可能存在CD8+的Th和Ts平衡失調(diào),使其外周血CD8+細(xì)胞比例升高,但確切機理有待進(jìn)一步研究。IL-2和IFN-γ系Th1所產(chǎn)生,IL-4和IL-10由Th2產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)AA大鼠脾細(xì)胞IL-2mRNA水平較對照組增高,IL-10、IL-4和IFN-γmRNA水平較對照組明顯降低,提示AA大鼠的Th1功能異常、Th2功能降低,與AA大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹及免疫功能紊亂具有密切關(guān)系。上述結(jié)果提示,細(xì)胞免疫功能紊亂,尤其是Th1和Th2、Th和Ts之間的平衡紊亂是AA大鼠免疫功能異常的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)之一。RA病人多同時表現(xiàn)有體液和細(xì)胞免疫功能的異常,這可能是AA大鼠免疫功能紊亂與RA