中華鱉精子頭發(fā)育超微結(jié)構(gòu)的變化

中華鱉精子頭發(fā)育超微結(jié)構(gòu)的變化

動物的超微結(jié)構(gòu)研究主要集中在牛奶和昆蟲上，其他動物的實(shí)驗(yàn)報(bào)告相對較少。不同種類的動物,其精子發(fā)生的形態(tài)變化過程存在差異,精子細(xì)胞的變態(tài)機(jī)制爭議更大。關(guān)于爬行動物精子形成的研究,有鱗目的蜥蜴類和蛇類已有報(bào)道,但龜鱉目精子發(fā)生的變態(tài)過程描述很少。中華鱉是我國養(yǎng)殖最廣泛的水生爬行動物,具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值,尤其最近有人開始了中華鱉的繁殖生物技術(shù)的研究,需要對中華鱉的精子特性和生殖細(xì)胞的形成過程進(jìn)行詳細(xì)詮釋。精子頭部主要包括細(xì)胞核和頂體,是精子結(jié)構(gòu)和功能的最重要部分。本實(shí)驗(yàn)室曾觀察了中華鱉成熟精子的結(jié)構(gòu)特性,發(fā)現(xiàn)中華鱉的精子形態(tài)與其他爬行類差異明顯。本文進(jìn)一步應(yīng)用透射電鏡技術(shù),觀測了中華鱉精子頭部形成過程的超微變化規(guī)律,并與其他動物進(jìn)行比較,為深入研究動物精子發(fā)生的變態(tài)機(jī)理和中華鱉的生殖生物學(xué)特性提供形態(tài)基礎(chǔ)。1睪丸的制備和重建2005年9月25日,10只中華鱉購自南京市惠民橋水產(chǎn)市場,均為人工池塘養(yǎng)殖2—3齡的性成熟雄鱉,650—800g/只。此期均在繁殖季節(jié),健康狀態(tài)良好,買來后立即宰殺,掀開腹甲,每只任選一側(cè)睪丸切取組織塊。將睪丸組織修切成1mm3小塊,固定于2.5%戊二醛PBS液中,4℃過夜,PBS洗滌,1%鋨酸后固定1h,上行梯度酒精脫水,至100%乙醇后,丙酮置換,Epon812包埋。LKB切片機(jī)超薄切片,醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,JEM-100CXII型透射電鏡觀察并拍照。2結(jié)果2.1均勻微細(xì)的粒度中華鱉精子細(xì)胞核呈飽滿的圓球形,位于細(xì)胞中央,染色質(zhì)為均勻細(xì)小的顆粒狀(圖版I:1,2),著色淡,核大小約為2.8μm×3μm。胞質(zhì)內(nèi)圓形線粒體稀少,線粒體嵴為板狀。滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為平行排列的扁囊狀(圖版Ⅰ:1)。2.2第期核型核的發(fā)育與發(fā)育精子頭部的形成過程的形態(tài)變化主要包括頂體的形成、細(xì)胞核濃縮以及細(xì)胞核拉長變細(xì)。根據(jù)不同階段的主要形態(tài)事件,本實(shí)驗(yàn)將中華鱉精子頭部的形成過程分為5個(gè)連續(xù)時(shí)期:第Ⅰ期精子細(xì)胞開始變態(tài)時(shí),由高爾基復(fù)合體分泌形成的前頂體泡移動到細(xì)胞核一側(cè)(圖版Ⅰ:1),泡內(nèi)含有非均質(zhì)狀物。前頂體泡同側(cè)的細(xì)胞核膜變平坦(圖版Ⅰ:1),并與前頂體泡接近。隨后,平坦的核膜逐漸向內(nèi)凹陷,前頂體泡不斷變大,并嵌于核膜凹陷內(nèi)(圖版Ⅰ:2)。前頂體泡內(nèi)變得清亮,高爾基復(fù)合體始終位于其附近。胞核凹陷稍加深,但最終呈一淺窩(圖版Ⅰ:2—6)。細(xì)胞核開始向精子細(xì)胞一側(cè)移動,移動時(shí)前頂體泡在前端。同時(shí)圓形的細(xì)胞核開始變形,呈前端窄小后端寬大的梨形(圖版Ⅰ:3,4)。前頂體泡底部中央出現(xiàn)一個(gè)電子致密的小顆粒,為頂體顆粒(圖版Ⅰ:4)。頂體底部與細(xì)胞核之間產(chǎn)生一薄層纖維物質(zhì)層(圖版Ⅰ:4),此纖維物質(zhì)層不斷增厚并致密(圖版Ⅰ:5—8)。高倍電鏡下,于纖維物質(zhì)層胞核一側(cè)的中央,正對著頂體顆粒有一更小的頂體下顆粒(圖版Ⅰ:5)。隨后,頂體下顆粒消失,但核前端中央繼而出現(xiàn)一條短的致密帶(圖版Ⅰ:6)。致密帶逐漸向后延長(圖版Ⅰ:8),并可增至2—4條(圖版Ⅱ:9),將發(fā)育成為核內(nèi)小管。第I期細(xì)胞核染色質(zhì)與精子細(xì)胞核一樣,一直呈均勻細(xì)小的淡染顆粒(圖版Ⅰ:3,4),此時(shí)核大小約2.6μm×3μm。第Ⅱ期細(xì)胞核凹窩向外隆突(圖版Ⅰ:7),推動并頂壓前頂體泡由圓形逐漸變扁,此過程由凹窩中央波及周圍,最終使得頂體囊覆蓋于核前端(圖版Ⅰ:8),內(nèi)外兩層頂體膜平行排列,形成頂體帽。同時(shí),頂體顆粒在扁囊狀的頂體內(nèi)彌散開來,使原來清亮的前頂體泡變成中等電子致密物(圖版Ⅰ:7,8,圖版Ⅱ:13,15)。細(xì)胞核進(jìn)一步端移和拉長。頂體帽外膜與精子細(xì)胞膜接近,而頂體帽內(nèi)膜底部與細(xì)胞核之間的纖維物質(zhì)層增厚且變得更致密(圖版Ⅰ:8,圖版Ⅱ:9),將來形成頂體下錐(圖版Ⅱ:15—18)。頂體帽內(nèi)外膜之間腔隙狹窄,但頂體帽后端略膨大,與核肩相接(圖版Ⅰ:8)。核內(nèi)染色質(zhì)開始濃縮,由原來淡染的細(xì)小顆粒逐漸融合成粗大致密的顆粒狀(圖版Ⅱ:10—12),顆粒之間的間隙清亮明顯,但顆粒與顆粒之間有細(xì)絲相連,形似結(jié)晶狀(圖版Ⅱ:10)。由于染色質(zhì)濃縮,細(xì)胞核體積變小,核膜與核質(zhì)之間出現(xiàn)間隙,雙層核膜也變得松弛彎曲(圖版Ⅱ:11),但未見核膜消失和再生現(xiàn)象,此時(shí)核大小約為3.2μm×1.1μm。核周圍出現(xiàn)微管組裝,這些微管圍繞細(xì)胞核,形成環(huán)形核套結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ:8,圖版Ⅱ:11,13)。在細(xì)胞核的縱切面上,環(huán)形核套微管被橫切而呈細(xì)小泡狀(圖版Ⅰ:8);相反,在細(xì)胞核的橫切面上,環(huán)形核套微管則被縱切而呈細(xì)管狀(圖版Ⅱ:11)。高倍電鏡下,核套微管之間有短橋相連。第Ⅲ期細(xì)胞核變得前尖后寬,核后端凹陷形成植入窩,中心粒移入此處(圖版Ⅱ:12),將參與頸部的結(jié)構(gòu)發(fā)育。細(xì)胞核更加濃縮,染色質(zhì)顆粒間隙變小。在頂體下端,細(xì)胞膜與核膜緊貼(圖版Ⅱ:13),將來發(fā)育成頂體后環(huán)。環(huán)形核套微管在頂體后環(huán)之后環(huán)繞細(xì)胞核排列(圖版Ⅱ:13)。胞核繼續(xù)拉長,前端有頂體覆蓋的部分已經(jīng)凸出于精子細(xì)胞外,而大部分細(xì)胞質(zhì)向后拖(圖版Ⅱ:13),核大小約為3.3μm×0.7μm。第Ⅳ期致密而粗大的染色質(zhì)顆粒相互融合,顆粒間隙逐漸消失,致使細(xì)胞核濃縮成電子致密的均質(zhì)狀(圖版Ⅱ:14—18)。在頂體周圍和前端,支持細(xì)胞的突起形成特殊的“袖領(lǐng)”結(jié)構(gòu)并包繞頂體(圖版Ⅱ:15,16),或者說精子頂體插入到支持細(xì)胞突起形成的“袖領(lǐng)”中。在細(xì)胞核的斜切面上,可見核周圍原來環(huán)形排列的核套微管變成斜行分布(圖版Ⅱ:14),隨后斜行微管又沿細(xì)胞核長軸方向縱向排列(圖版Ⅱ:15,圖版Ⅰ:3),形成縱行核套。此時(shí),細(xì)胞核前部變得窄細(xì)并向前延伸,形成核前突,其表面直接與頂體下錐相接(圖版Ⅱ:15—18),此時(shí)核體積進(jìn)一步縮小,大小約為2.7μm×0.4μm。核前突基部變寬,為核肩。第Ⅴ期縱行核套消失,頂體前端特殊的“袖領(lǐng)”也隨之退縮(圖版Ⅱ:17,18),頂體帽與頂體下錐的形狀與核前突對應(yīng),頂體下錐緊密覆蓋核前突,其頂端寬厚,兩側(cè)由上而下逐漸變薄(圖版Ⅱ:17),并與頂體帽后端一起止于核肩。頂體帽與頂體下錐之間出現(xiàn)狹窄的頂體下間隙。核內(nèi)小管發(fā)育明顯,向前伸出核前突的前端,與頂體下錐連接(圖版Ⅱ:17),向后伸達(dá)胞核長度的2/3,經(jīng)常見到2條或多條核內(nèi)小管排列(圖版Ⅱ:18),此時(shí)核拉長完成,大小約為2.7μm×0.3μm。精子頭部基本發(fā)育成形后,尾部隨之形成(圖版Ⅱ:19)。3討論3.1精子骨錨類型與鳥類相似性精子形成過程中,頭部細(xì)胞核的變化主要表現(xiàn)在細(xì)胞核的拉長變形和核質(zhì)的濃縮兩個(gè)方面。兩棲類泰國葉蛙(Thaileaffrog,Megophrysmontana)和中國雨蛙(Hylachinensis)精子發(fā)生過程中,細(xì)胞核周圍未見核套形成。但鳥類精子形成時(shí)出現(xiàn)了微管構(gòu)成的核套,而且不同的報(bào)道存在一定差異。公雞(Gallusdomesticus)精子形成過程中,精子細(xì)胞核周圍出現(xiàn)了環(huán)形核套微管,而美洲鴕鳥(RheaAmericansalbisceus)精子細(xì)胞變態(tài)時(shí),精子細(xì)胞核周圍先形成環(huán)形核套,后出現(xiàn)縱行核套,而且在兩種形式核套之間還發(fā)現(xiàn)過渡的斜行核套。核套具有一定緊縮力,有利于精子細(xì)胞核的拉長和變細(xì)。在爬行動物中,有鱗目的北草蜥(Takydromusseptentrionalis)、漁游蛇(Natrixpiscator)和赤鏈蛇(Dinnodonrufozonatum)精子細(xì)胞內(nèi)沒有觀察到核套,只是在支持細(xì)胞中觀察到縱行排列的微管束,更未見環(huán)形和斜行核套出現(xiàn)。龜鱉目中,龜類核套的情況未見報(bào)道。中華鱉精子形成時(shí),先后出現(xiàn)環(huán)形(圖版Ⅱ:11)、斜行(圖版Ⅱ:14)和縱行(圖版Ⅱ:15)核套,這些核套是由平行排列的微管束構(gòu)成?？梢?在精子頭部變形過程中,中華鱉出現(xiàn)核套的情況與鳥類相似。近年來,在動物系統(tǒng)發(fā)生研究中,通過分析mtDNA和22種核基因序列數(shù)據(jù),把龜鱉類和鱷類列在一起,與鳥類親緣關(guān)系接近,而把有鱗目放在爬行類系統(tǒng)發(fā)生的基部,與兩棲類親緣關(guān)系接近。這也得到了本實(shí)驗(yàn)的部分形態(tài)學(xué)支持。3.2形態(tài)變化對精子細(xì)胞核的影響兩棲類中國雨蛙精子細(xì)胞核內(nèi),顆粒狀染色質(zhì)首先聚集成卷曲的柱狀結(jié)構(gòu),隨后卷曲伸直,形成精子頭部。在此過程中,核膜數(shù)次更新,核內(nèi)濃縮出的多余物質(zhì)漸次從核中排出,致使細(xì)胞核達(dá)到濃縮的目的。鳥類的美洲鴕和公雞精子細(xì)胞核的變化過程與雨蛙明顯不同,核質(zhì)濃縮過程未經(jīng)過柱狀體的卷曲狀結(jié)構(gòu),核膜也沒有發(fā)生更新,兩者的染色質(zhì)沒有形成粗大顆粒的形式。已有的爬行動物研究中,有鱗目的北草蜥和漁游蛇精子細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮成顆粒狀,而且顆粒的形態(tài)屬于纖維型,呈長棒狀的纖維顆粒,沿拉長的細(xì)胞核縱軸有序排列,最后這些顆粒濃縮并融合成均質(zhì)致密狀。中華鱉精子細(xì)胞核濃縮時(shí),雖然染色質(zhì)也形成顆粒狀,但這些顆粒并非纖維狀,而是呈大小基本一致的圓形(圖版Ⅱ:11,12),而且顆粒之間有許多細(xì)絲相連,形似冰晶狀(圖版Ⅱ:10)。隨著染色質(zhì)的進(jìn)一步濃縮,中華鱉染色質(zhì)顆粒間隙變小,直至間隙消失,核質(zhì)呈均質(zhì)狀。核質(zhì)與核膜之間出現(xiàn)明顯間隙,核膜也變得松弛彎曲,但未見核膜的消失與再生現(xiàn)象發(fā)生。這表明,精子細(xì)胞核濃縮的形態(tài)變化過程中,不同綱動物之間存在明顯差異,兩棲類和爬行類的染色質(zhì)出現(xiàn)明顯顆粒化過程,而且顆粒的形狀也不同。關(guān)于細(xì)胞核濃縮的機(jī)械原理,McIntosh(1967)認(rèn)為公雞精子細(xì)胞核周圍的環(huán)形核套可以提供一種機(jī)械力,擠壓細(xì)胞核內(nèi)容物,引起細(xì)胞核濃縮。但有些鳥類(Crotophagaani)的精子形成過程中,精子細(xì)胞中沒有核套微管出現(xiàn),而它們的支持細(xì)胞中分布著豐富的微管束,將承擔(dān)機(jī)械收縮力的作用。美洲鴕鳥的精子發(fā)生過程中出現(xiàn)典型的核套,但并不認(rèn)為核套與核質(zhì)濃縮有關(guān),而是可能具有其他功能。在兩棲類,研究泰國葉蛙精子形成時(shí),發(fā)現(xiàn)在沒有核套微管的條件下染色質(zhì)仍能完成濃縮過程,它們的核濃縮是通過核內(nèi)低電子密度物質(zhì)連同多余舊核膜一起排出來實(shí)現(xiàn)。更有人通過果蠅(Drosophilamelanogaster)突變體實(shí)驗(yàn)和秋水仙素或抗微管抗體抑制微管實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在沒有微管的情況下,細(xì)胞核雖然不能拉長,但可以完成濃縮過程。可見,精子形成過程中核濃縮的機(jī)械力,在不同的動物得出的結(jié)論不一致,有的來自精子細(xì)胞本身的核套,有的來自相鄰支持細(xì)胞的微管束,還有的是精子細(xì)胞核內(nèi)部的作用所致。本實(shí)驗(yàn)觀察中華鱉精子細(xì)胞核變形時(shí),環(huán)形核套的出現(xiàn)與染色質(zhì)開始濃縮的時(shí)間基本同步(圖版Ⅰ:8),隨著環(huán)形核套進(jìn)一步的發(fā)達(dá)完善,核內(nèi)染色質(zhì)更加濃縮(圖版Ⅱ:11,14)。當(dāng)環(huán)形核套逐漸向斜行發(fā)展時(shí),核內(nèi)染色質(zhì)也高度濃縮成致密的均質(zhì)狀,顆粒間隙消失(圖版Ⅱ:14)。細(xì)胞核濃縮過程完成時(shí),核套微管也完全由環(huán)形改建為縱行,沿細(xì)胞核長軸平行排列(圖版Ⅱ:15),此后細(xì)胞核進(jìn)一步拉長變細(xì),最終成為精子頭部主要結(jié)構(gòu)(圖版Ⅱ:17)。從此過程中我們可以看出,環(huán)形核套出現(xiàn)與核內(nèi)染色質(zhì)的濃縮時(shí)間和濃縮狀態(tài)基本吻合,而且當(dāng)染色質(zhì)濃縮完成時(shí),環(huán)形經(jīng)過斜行改建成縱行核套,直至精子細(xì)胞核完成拉長變形后,縱行核套消失(圖版Ⅱ:17)。從形態(tài)變化過程我們可以推測,中華鱉精子形成過程中,環(huán)形核套除了與細(xì)胞核變細(xì)拉長有關(guān)外,還為染色質(zhì)濃縮提供機(jī)械收縮力,促進(jìn)核質(zhì)濃縮;斜行核套是環(huán)形核套向縱行核套改建過程的一種過渡形式;縱行核套可以產(chǎn)生緊束力,參與細(xì)胞核拉長和最后形態(tài)的形成。近些年來,人們從分子生物學(xué)水平開始研究哺乳動物精子細(xì)胞細(xì)胞核濃縮的分子機(jī)制。精子形成過程中伴隨精子細(xì)胞核濃縮,核蛋白類型發(fā)生明顯改變。早期精子細(xì)胞及其以前的生精細(xì)胞的核蛋白為組蛋白,富含賴氨酸。當(dāng)圓形精子細(xì)胞伸長時(shí),組蛋白由過渡蛋白(transitionalprotein)取代,到晚期精子細(xì)胞階段,富含精氨酸和胱氨酸的魚精蛋白又逐漸替代了過渡蛋白。魚精蛋白的作用主要是中和DNA的電荷,降低DNA分子間的靜電排斥,并使染色質(zhì)高度濃縮,同時(shí)其分子中的胱氨酸可形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵,使?jié)饪s的核更穩(wěn)定。這種哺乳動物精子細(xì)胞核濃縮的分子機(jī)理是否相適用于中華鱉,有待于進(jìn)一步的研究。3.3頂體顆粒的觀察和觀察關(guān)于爬行動物頂體的形成過程,在蜥蜴類研究的比較多,而且各具特點(diǎn)。首先,在細(xì)胞核凹陷方面,斑鬣蜥(Agamastellio)精子頂體泡形成過程中細(xì)胞核先出現(xiàn)兩個(gè)凹陷的頂體囊泡,后合并為一個(gè)大頂體囊泡,凹陷呈深杯狀。而嵴尾蜥(Tropidurus)在核凹陷時(shí)整個(gè)頂體囊泡完全陷入在細(xì)胞核內(nèi)。北草蜥和其他蜥蜴的頂體囊泡一半陷入到核中,另一半突出于核外,凹陷也呈深杯狀。中華鱉精子形成時(shí),細(xì)胞核一側(cè)也產(chǎn)生凹窩,前頂體泡位于此處,但凹陷的深度要比上述動物的淺,第Ⅱ期凹陷向外突起而消失。其次,在頂體顆粒方面,其存在時(shí)間和數(shù)量在不同爬行動物間有差別。赤鏈蛇和北草蜥的頂體顆粒在第Ⅱ期一直存在,但嵴尾蜥和黑眉錦蛇(Elaphetaeniura)的頂體顆粒在第Ⅱ期則消失;西亞鬣蜥(Agamablandifordi)和短頸南蜥(Mabuyabrevicollis)的頂體囊泡中出現(xiàn)兩個(gè)頂體顆粒,分別形成頂體帽中的電子致密層和半電子透明層。中華鱉的頂體顆粒只有一個(gè),而且明顯比其他動物要小,隨著細(xì)胞核凹陷的前突和前頂體泡的變扁,頂體顆粒在頂體囊中彌散開來。但同樣是龜鱉目,紅耳龜(Pseudemysscripta)則未觀察到頂體顆粒?？梢?與其他動物相比,中華鱉頂體顆粒的大小和變化過程具有一定特殊性。3.4頂體下顆粒的變化爬行動物精子頂體的形成已有描述,但核內(nèi)小管的發(fā)育過程未曾見報(bào)道。北草蜥在前頂體泡時(shí)期,頂體下顆粒出現(xiàn),并將頂體顆粒與核膜連接起來。直到頭部發(fā)育晚期核質(zhì)濃縮