中華鱉精子頭發(fā)育超微結構的變化

中華鱉精子頭發(fā)育超微結構的變化

動物的超微結構研究主要集中在牛奶和昆蟲上，其他動物的實驗報告相對較少。不同種類的動物,其精子發(fā)生的形態(tài)變化過程存在差異,精子細胞的變態(tài)機制爭議更大。關于爬行動物精子形成的研究,有鱗目的蜥蜴類和蛇類已有報道,但龜鱉目精子發(fā)生的變態(tài)過程描述很少。中華鱉是我國養(yǎng)殖最廣泛的水生爬行動物,具有重要的經濟和藥用價值,尤其最近有人開始了中華鱉的繁殖生物技術的研究,需要對中華鱉的精子特性和生殖細胞的形成過程進行詳細詮釋。精子頭部主要包括細胞核和頂體,是精子結構和功能的最重要部分。本實驗室曾觀察了中華鱉成熟精子的結構特性,發(fā)現(xiàn)中華鱉的精子形態(tài)與其他爬行類差異明顯。本文進一步應用透射電鏡技術,觀測了中華鱉精子頭部形成過程的超微變化規(guī)律,并與其他動物進行比較,為深入研究動物精子發(fā)生的變態(tài)機理和中華鱉的生殖生物學特性提供形態(tài)基礎。1睪丸的制備和重建2005年9月25日,10只中華鱉購自南京市惠民橋水產市場,均為人工池塘養(yǎng)殖2—3齡的性成熟雄鱉,650—800g/只。此期均在繁殖季節(jié),健康狀態(tài)良好,買來后立即宰殺,掀開腹甲,每只任選一側睪丸切取組織塊。將睪丸組織修切成1mm3小塊,固定于2.5%戊二醛PBS液中,4℃過夜,PBS洗滌,1%鋨酸后固定1h,上行梯度酒精脫水,至100%乙醇后,丙酮置換,Epon812包埋。LKB切片機超薄切片,醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,JEM-100CXII型透射電鏡觀察并拍照。2結果2.1均勻微細的粒度中華鱉精子細胞核呈飽滿的圓球形,位于細胞中央,染色質為均勻細小的顆粒狀(圖版I:1,2),著色淡,核大小約為2.8μm×3μm。胞質內圓形線粒體稀少,線粒體嵴為板狀?；鎯荣|網為平行排列的扁囊狀(圖版Ⅰ:1)。2.2第期核型核的發(fā)育與發(fā)育精子頭部的形成過程的形態(tài)變化主要包括頂體的形成、細胞核濃縮以及細胞核拉長變細。根據不同階段的主要形態(tài)事件,本實驗將中華鱉精子頭部的形成過程分為5個連續(xù)時期:第Ⅰ期精子細胞開始變態(tài)時,由高爾基復合體分泌形成的前頂體泡移動到細胞核一側(圖版Ⅰ:1),泡內含有非均質狀物。前頂體泡同側的細胞核膜變平坦(圖版Ⅰ:1),并與前頂體泡接近。隨后,平坦的核膜逐漸向內凹陷,前頂體泡不斷變大,并嵌于核膜凹陷內(圖版Ⅰ:2)。前頂體泡內變得清亮,高爾基復合體始終位于其附近。胞核凹陷稍加深,但最終呈一淺窩(圖版Ⅰ:2—6)。細胞核開始向精子細胞一側移動,移動時前頂體泡在前端。同時圓形的細胞核開始變形,呈前端窄小后端寬大的梨形(圖版Ⅰ:3,4)。前頂體泡底部中央出現(xiàn)一個電子致密的小顆粒,為頂體顆粒(圖版Ⅰ:4)。頂體底部與細胞核之間產生一薄層纖維物質層(圖版Ⅰ:4),此纖維物質層不斷增厚并致密(圖版Ⅰ:5—8)。高倍電鏡下,于纖維物質層胞核一側的中央,正對著頂體顆粒有一更小的頂體下顆粒(圖版Ⅰ:5)。隨后,頂體下顆粒消失,但核前端中央繼而出現(xiàn)一條短的致密帶(圖版Ⅰ:6)。致密帶逐漸向后延長(圖版Ⅰ:8),并可增至2—4條(圖版Ⅱ:9),將發(fā)育成為核內小管。第I期細胞核染色質與精子細胞核一樣,一直呈均勻細小的淡染顆粒(圖版Ⅰ:3,4),此時核大小約2.6μm×3μm。第Ⅱ期細胞核凹窩向外隆突(圖版Ⅰ:7),推動并頂壓前頂體泡由圓形逐漸變扁,此過程由凹窩中央波及周圍,最終使得頂體囊覆蓋于核前端(圖版Ⅰ:8),內外兩層頂體膜平行排列,形成頂體帽。同時,頂體顆粒在扁囊狀的頂體內彌散開來,使原來清亮的前頂體泡變成中等電子致密物(圖版Ⅰ:7,8,圖版Ⅱ:13,15)。細胞核進一步端移和拉長。頂體帽外膜與精子細胞膜接近,而頂體帽內膜底部與細胞核之間的纖維物質層增厚且變得更致密(圖版Ⅰ:8,圖版Ⅱ:9),將來形成頂體下錐(圖版Ⅱ:15—18)。頂體帽內外膜之間腔隙狹窄,但頂體帽后端略膨大,與核肩相接(圖版Ⅰ:8)。核內染色質開始濃縮,由原來淡染的細小顆粒逐漸融合成粗大致密的顆粒狀(圖版Ⅱ:10—12),顆粒之間的間隙清亮明顯,但顆粒與顆粒之間有細絲相連,形似結晶狀(圖版Ⅱ:10)。由于染色質濃縮,細胞核體積變小,核膜與核質之間出現(xiàn)間隙,雙層核膜也變得松弛彎曲(圖版Ⅱ:11),但未見核膜消失和再生現(xiàn)象,此時核大小約為3.2μm×1.1μm。核周圍出現(xiàn)微管組裝,這些微管圍繞細胞核,形成環(huán)形核套結構(圖版Ⅰ:8,圖版Ⅱ:11,13)。在細胞核的縱切面上,環(huán)形核套微管被橫切而呈細小泡狀(圖版Ⅰ:8);相反,在細胞核的橫切面上,環(huán)形核套微管則被縱切而呈細管狀(圖版Ⅱ:11)。高倍電鏡下,核套微管之間有短橋相連。第Ⅲ期細胞核變得前尖后寬,核后端凹陷形成植入窩,中心粒移入此處(圖版Ⅱ:12),將參與頸部的結構發(fā)育。細胞核更加濃縮,染色質顆粒間隙變小。在頂體下端,細胞膜與核膜緊貼(圖版Ⅱ:13),將來發(fā)育成頂體后環(huán)。環(huán)形核套微管在頂體后環(huán)之后環(huán)繞細胞核排列(圖版Ⅱ:13)。胞核繼續(xù)拉長,前端有頂體覆蓋的部分已經凸出于精子細胞外,而大部分細胞質向后拖(圖版Ⅱ:13),核大小約為3.3μm×0.7μm。第Ⅳ期致密而粗大的染色質顆粒相互融合,顆粒間隙逐漸消失,致使細胞核濃縮成電子致密的均質狀(圖版Ⅱ:14—18)。在頂體周圍和前端,支持細胞的突起形成特殊的“袖領”結構并包繞頂體(圖版Ⅱ:15,16),或者說精子頂體插入到支持細胞突起形成的“袖領”中。在細胞核的斜切面上,可見核周圍原來環(huán)形排列的核套微管變成斜行分布(圖版Ⅱ:14),隨后斜行微管又沿細胞核長軸方向縱向排列(圖版Ⅱ:15,圖版Ⅰ:3),形成縱行核套。此時,細胞核前部變得窄細并向前延伸,形成核前突,其表面直接與頂體下錐相接(圖版Ⅱ:15—18),此時核體積進一步縮小,大小約為2.7μm×0.4μm。核前突基部變寬,為核肩。第Ⅴ期縱行核套消失,頂體前端特殊的“袖領”也隨之退縮(圖版Ⅱ:17,18),頂體帽與頂體下錐的形狀與核前突對應,頂體下錐緊密覆蓋核前突,其頂端寬厚,兩側由上而下逐漸變薄(圖版Ⅱ:17),并與頂體帽后端一起止于核肩。頂體帽與頂體下錐之間出現(xiàn)狹窄的頂體下間隙。核內小管發(fā)育明顯,向前伸出核前突的前端,與頂體下錐連接(圖版Ⅱ:17),向后伸達胞核長度的2/3,經常見到2條或多條核內小管排列(圖版Ⅱ:18),此時核拉長完成,大小約為2.7μm×0.3μm。精子頭部基本發(fā)育成形后,尾部隨之形成(圖版Ⅱ:19)。3討論3.1精子骨錨類型與鳥類相似性精子形成過程中,頭部細胞核的變化主要表現(xiàn)在細胞核的拉長變形和核質的濃縮兩個方面。兩棲類泰國葉蛙(Thaileaffrog,Megophrysmontana)和中國雨蛙(Hylachinensis)精子發(fā)生過程中,細胞核周圍未見核套形成。但鳥類精子形成時出現(xiàn)了微管構成的核套,而且不同的報道存在一定差異。公雞(Gallusdomesticus)精子形成過程中,精子細胞核周圍出現(xiàn)了環(huán)形核套微管,而美洲鴕鳥(RheaAmericansalbisceus)精子細胞變態(tài)時,精子細胞核周圍先形成環(huán)形核套,后出現(xiàn)縱行核套,而且在兩種形式核套之間還發(fā)現(xiàn)過渡的斜行核套。核套具有一定緊縮力,有利于精子細胞核的拉長和變細。在爬行動物中,有鱗目的北草蜥(Takydromusseptentrionalis)、漁游蛇(Natrixpiscator)和赤鏈蛇(Dinnodonrufozonatum)精子細胞內沒有觀察到核套,只是在支持細胞中觀察到縱行排列的微管束,更未見環(huán)形和斜行核套出現(xiàn)。龜鱉目中,龜類核套的情況未見報道。中華鱉精子形成時,先后出現(xiàn)環(huán)形(圖版Ⅱ:11)、斜行(圖版Ⅱ:14)和縱行(圖版Ⅱ:15)核套,這些核套是由平行排列的微管束構成?？梢?在精子頭部變形過程中,中華鱉出現(xiàn)核套的情況與鳥類相似。近年來,在動物系統(tǒng)發(fā)生研究中,通過分析mtDNA和22種核基因序列數(shù)據,把龜鱉類和鱷類列在一起,與鳥類親緣關系接近,而把有鱗目放在爬行類系統(tǒng)發(fā)生的基部,與兩棲類親緣關系接近。這也得到了本實驗的部分形態(tài)學支持。3.2形態(tài)變化對精子細胞核的影響兩棲類中國雨蛙精子細胞核內,顆粒狀染色質首先聚集成卷曲的柱狀結構,隨后卷曲伸直,形成精子頭部。在此過程中,核膜數(shù)次更新,核內濃縮出的多余物質漸次從核中排出,致使細胞核達到濃縮的目的。鳥類的美洲鴕和公雞精子細胞核的變化過程與雨蛙明顯不同,核質濃縮過程未經過柱狀體的卷曲狀結構,核膜也沒有發(fā)生更新,兩者的染色質沒有形成粗大顆粒的形式。已有的爬行動物研究中,有鱗目的北草蜥和漁游蛇精子細胞核染色質濃縮成顆粒狀,而且顆粒的形態(tài)屬于纖維型,呈長棒狀的纖維顆粒,沿拉長的細胞核縱軸有序排列,最后這些顆粒濃縮并融合成均質致密狀。中華鱉精子細胞核濃縮時,雖然染色質也形成顆粒狀,但這些顆粒并非纖維狀,而是呈大小基本一致的圓形(圖版Ⅱ:11,12),而且顆粒之間有許多細絲相連,形似冰晶狀(圖版Ⅱ:10)。隨著染色質的進一步濃縮,中華鱉染色質顆粒間隙變小,直至間隙消失,核質呈均質狀。核質與核膜之間出現(xiàn)明顯間隙,核膜也變得松弛彎曲,但未見核膜的消失與再生現(xiàn)象發(fā)生。這表明,精子細胞核濃縮的形態(tài)變化過程中,不同綱動物之間存在明顯差異,兩棲類和爬行類的染色質出現(xiàn)明顯顆粒化過程,而且顆粒的形狀也不同。關于細胞核濃縮的機械原理,McIntosh(1967)認為公雞精子細胞核周圍的環(huán)形核套可以提供一種機械力,擠壓細胞核內容物,引起細胞核濃縮。但有些鳥類(Crotophagaani)的精子形成過程中,精子細胞中沒有核套微管出現(xiàn),而它們的支持細胞中分布著豐富的微管束,將承擔機械收縮力的作用。美洲鴕鳥的精子發(fā)生過程中出現(xiàn)典型的核套,但并不認為核套與核質濃縮有關,而是可能具有其他功能。在兩棲類,研究泰國葉蛙精子形成時,發(fā)現(xiàn)在沒有核套微管的條件下染色質仍能完成濃縮過程,它們的核濃縮是通過核內低電子密度物質連同多余舊核膜一起排出來實現(xiàn)。更有人通過果蠅(Drosophilamelanogaster)突變體實驗和秋水仙素或抗微管抗體抑制微管實驗,發(fā)現(xiàn)在沒有微管的情況下,細胞核雖然不能拉長,但可以完成濃縮過程?？梢?精子形成過程中核濃縮的機械力,在不同的動物得出的結論不一致,有的來自精子細胞本身的核套,有的來自相鄰支持細胞的微管束,還有的是精子細胞核內部的作用所致。本實驗觀察中華鱉精子細胞核變形時,環(huán)形核套的出現(xiàn)與染色質開始濃縮的時間基本同步(圖版Ⅰ:8),隨著環(huán)形核套進一步的發(fā)達完善,核內染色質更加濃縮(圖版Ⅱ:11,14)。當環(huán)形核套逐漸向斜行發(fā)展時,核內染色質也高度濃縮成致密的均質狀,顆粒間隙消失(圖版Ⅱ:14)。細胞核濃縮過程完成時,核套微管也完全由環(huán)形改建為縱行,沿細胞核長軸平行排列(圖版Ⅱ:15),此后細胞核進一步拉長變細,最終成為精子頭部主要結構(圖版Ⅱ:17)。從此過程中我們可以看出,環(huán)形核套出現(xiàn)與核內染色質的濃縮時間和濃縮狀態(tài)基本吻合,而且當染色質濃縮完成時,環(huán)形經過斜行改建成縱行核套,直至精子細胞核完成拉長變形后,縱行核套消失(圖版Ⅱ:17)。從形態(tài)變化過程我們可以推測,中華鱉精子形成過程中,環(huán)形核套除了與細胞核變細拉長有關外,還為染色質濃縮提供機械收縮力,促進核質濃縮;斜行核套是環(huán)形核套向縱行核套改建過程的一種過渡形式;縱行核套可以產生緊束力,參與細胞核拉長和最后形態(tài)的形成。近些年來,人們從分子生物學水平開始研究哺乳動物精子細胞細胞核濃縮的分子機制。精子形成過程中伴隨精子細胞核濃縮,核蛋白類型發(fā)生明顯改變。早期精子細胞及其以前的生精細胞的核蛋白為組蛋白,富含賴氨酸。當圓形精子細胞伸長時,組蛋白由過渡蛋白(transitionalprotein)取代,到晚期精子細胞階段,富含精氨酸和胱氨酸的魚精蛋白又逐漸替代了過渡蛋白。魚精蛋白的作用主要是中和DNA的電荷,降低DNA分子間的靜電排斥,并使染色質高度濃縮,同時其分子中的胱氨酸可形成分子內或分子間的二硫鍵,使?jié)饪s的核更穩(wěn)定。這種哺乳動物精子細胞核濃縮的分子機理是否相適用于中華鱉,有待于進一步的研究。3.3頂體顆粒的觀察和觀察關于爬行動物頂體的形成過程,在蜥蜴類研究的比較多,而且各具特點。首先,在細胞核凹陷方面,斑鬣蜥(Agamastellio)精子頂體泡形成過程中細胞核先出現(xiàn)兩個凹陷的頂體囊泡,后合并為一個大頂體囊泡,凹陷呈深杯狀。而嵴尾蜥(Tropidurus)在核凹陷時整個頂體囊泡完全陷入在細胞核內。北草蜥和其他蜥蜴的頂體囊泡一半陷入到核中,另一半突出于核外,凹陷也呈深杯狀。中華鱉精子形成時,細胞核一側也產生凹窩,前頂體泡位于此處,但凹陷的深度要比上述動物的淺,第Ⅱ期凹陷向外突起而消失。其次,在頂體顆粒方面,其存在時間和數(shù)量在不同爬行動物間有差別。赤鏈蛇和北草蜥的頂體顆粒在第Ⅱ期一直存在,但嵴尾蜥和黑眉錦蛇(Elaphetaeniura)的頂體顆粒在第Ⅱ期則消失;西亞鬣蜥(Agamablandifordi)和短頸南蜥(Mabuyabrevicollis)的頂體囊泡中出現(xiàn)兩個頂體顆粒,分別形成頂體帽中的電子致密層和半電子透明層。中華鱉的頂體顆粒只有一個,而且明顯比其他動物要小,隨著細胞核凹陷的前突和前頂體泡的變扁,頂體顆粒在頂體囊中彌散開來。但同樣是龜鱉目,紅耳龜(Pseudemysscripta)則未觀察到頂體顆粒?？梢?與其他動物相比,中華鱉頂體顆粒的大小和變化過程具有一定特殊性。3.4頂體下顆粒的變化爬行動物精子頂體的形成已有描述,但核內小管的發(fā)育過程未曾見報道。北草蜥在前頂體泡時期,頂體下顆粒出現(xiàn),并將頂體顆粒與核膜連接起來。直到頭部發(fā)育晚期核質濃縮