霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)課件

霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)霍亂的流行情況霍亂的生物學(xué)性狀樣本的采集檢驗(yàn)操作程序熒光定量PCR方法檢測(cè)O1群、O139群霍亂弧菌及霍亂毒素提綱2霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)由O1群、O139群霍亂弧菌引起的霍亂以發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣、能引起大流行為特征，被世界衛(wèi)生組織列為國(guó)境衛(wèi)生檢疫傳染病，也是我國(guó)傳染病防治法中規(guī)定強(qiáng)制管理的甲類傳染病。3霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)O1群霍亂弧菌的流行情況1817年~1923年發(fā)生六次霍亂的世界大流行均由O1群霍亂弧菌古典生物型引起1820年古典生物型引起的霍亂首次傳到我國(guó)1961年開始了第七次霍亂的世界大流行均由O1群霍亂弧菌埃爾托生物型引起（1905年發(fā)現(xiàn)）1961年埃爾托生物型霍亂首次傳到我國(guó)4霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)O139群霍亂弧菌的流行情況1992年印度馬德拉斯發(fā)生O139霍亂并迅速傳播1993年6月我國(guó)新疆發(fā)現(xiàn)O139霍亂流行。1994年我市發(fā)現(xiàn)O139霍亂疫情O1群和O139群霍亂弧菌與其他霍亂弧菌的最大區(qū)別是能產(chǎn)生相同的霍亂毒素5霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)弧菌的分類形態(tài)與染色抗原結(jié)構(gòu)、血清群生長(zhǎng)與培養(yǎng)特性生化反應(yīng)特性對(duì)外界的抵抗力藥物敏感性霍亂的生物學(xué)性狀6霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)弧菌的分類（包括5個(gè)屬）弧菌屬霍亂弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌等等氣單胞菌屬鄰單胞菌屬發(fā)光菌屬水棲菌屬霍亂的生物學(xué)性狀7霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)形態(tài)與染色革蘭氏染色陰性，兩端鈍圓或稍平單鞭毛、魚群樣排列，菌體彎曲呈弧形或逗點(diǎn)狀暗視野顯微鏡下，霍亂弧菌運(yùn)動(dòng)活潑，呈穿梭狀或流星狀培養(yǎng)基上菌落略帶灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑濕潤(rùn)霍亂的生物學(xué)性狀8霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)革蘭氏染色陰性，兩端鈍圓或稍平9霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)單鞭毛、魚群樣排列，菌體彎曲成弧形或逗點(diǎn)狀10霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)11霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)抗原結(jié)構(gòu)、血清群H抗原和O抗原根據(jù)O抗原不同，分為200多個(gè)血清型根據(jù)O抗原成分的不同分群特異性抗原因子和型特異性抗原因子O1群據(jù)型特異性抗原成分不同分為小川、稻葉、彥島三個(gè)血清型小川型含A、B抗原因子，也含少量C因子成分稻葉型含A、C因子彥島型含A、B、C因子霍亂的生物學(xué)性狀12霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

生長(zhǎng)與培養(yǎng)特性好氧同時(shí)兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度37℃鈉離子可刺激生長(zhǎng)耐堿不耐酸初次分離時(shí)常用堿性蛋白胨水(pH8.8-9.0)增菌培養(yǎng)，霍亂弧菌經(jīng)6～8h增菌后可在液體表面大量繁殖，形成菌膜霍亂的生物學(xué)性狀13霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)14霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

生化反應(yīng)特性兩個(gè)生物型的霍亂弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣遲緩發(fā)酵乳糖，不分解阿拉伯糖氧化酶試驗(yàn)弧菌屬細(xì)菌大多為陽(yáng)性粘絲實(shí)驗(yàn)弧菌屬細(xì)菌大多為陽(yáng)性霍亂的生物學(xué)性狀15霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

對(duì)外界的抵抗力在河、井、海水中可存活13周以上食物和海產(chǎn)品上存活7天左右對(duì)低溫和堿耐受力強(qiáng)（在食品上的弧菌于冰箱保存（0~5度）比室溫存活時(shí)間長(zhǎng)）對(duì)熱、干燥、太陽(yáng)直射敏感對(duì)含氯制劑、碘制劑敏感對(duì)酸和強(qiáng)氧化劑極敏感煮沸100度1~2min即可被殺死藥物敏感性細(xì)菌帶有可傳遞的耐藥質(zhì)粒近年產(chǎn)生多重耐藥株（丁胺卡那霉素、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明）諾氟沙星和環(huán)丙沙星對(duì)霍亂弧菌保持較高的敏感性

霍亂的生物學(xué)性狀16霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)霍亂的致病性主要毒素霍亂腸毒素CT小帶聯(lián)結(jié)毒素zot輔助霍亂腸毒素ace溶血素、溶細(xì)胞素、志賀樣毒素O139群除具有上述O1群的致病物質(zhì)外，還存在莢膜多糖和特殊LPS毒性決定簇，可抵抗血清中殺菌物質(zhì)和黏附到小腸黏膜上。

霍亂的生物學(xué)性狀17霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

腹瀉患者樣本采集水樣便采1~3ml，成形便取指甲大小量肛拭子：生理鹽水浸濕采便管由肛門插入直腸內(nèi)3~5cm處旋轉(zhuǎn)取出嘔吐物采1~3ml標(biāo)本和堿胨水比例為1：5水樣及液體標(biāo)本采集采集相對(duì)靜止表層水（30cm內(nèi)）500ml其他液體標(biāo)本采集500ml2~3小時(shí)內(nèi)送檢涂抹樣本采集2~3支無菌棉簽涂抹3~5只以上水生動(dòng)物表面、腮部及泄殖腔2~3支無菌棉簽涂抹食品或物品表面（地溝口，下水管口，水池壁涂抹，餐盤內(nèi)外側(cè)）直接放入10ml堿胨水送檢樣本的采集18霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)典型的米泔水樣便19霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

動(dòng)力試驗(yàn)水樣便：取一滴在玻片上，蓋蓋玻片，暗視野顯微鏡直接觀察成形便：取適量在生理鹽水中研磨，蓋蓋玻片，鏡下觀察高度可疑樣本：取增菌的堿胨水在玻片上，蓋蓋玻片，鏡下觀察鏡下有穿梭樣運(yùn)動(dòng)為動(dòng)力試驗(yàn)陽(yáng)性動(dòng)力抑制試驗(yàn)取O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清，取適量標(biāo)本在其中研磨穿梭樣運(yùn)動(dòng)消失，菌體凝集成塊為動(dòng)力抑制試驗(yàn)陽(yáng)性檢驗(yàn)操作程序20霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

增菌及分離培養(yǎng)堿性蛋白胨水pH8.8-9.0注意標(biāo)本和胨水的比例要適當(dāng)分離培養(yǎng)基分兩類選擇性強(qiáng)的培養(yǎng)基四號(hào)瓊脂、TCBS、慶大培養(yǎng)基選擇性弱的培養(yǎng)基堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂檢驗(yàn)操作程序21霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)霍亂弧菌在慶大培養(yǎng)基上菌落形態(tài)。(菌落呈現(xiàn)無色、圓形半透明、濕潤(rùn)、扁平或稍突起、邊緣整齊，由于亞碲酸鉀的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色）22霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)病人糞便標(biāo)本增菌３７℃6-8h慶大平皿劃線培養(yǎng)３７℃18-24h每皿挑取9-10個(gè)可疑菌落血清凝集試驗(yàn)向醫(yī)院屬地CDC報(bào)告醫(yī)學(xué)觀察病例霍亂分群診斷（單克隆抗體）Ｏ１群Ｏ１３９群

二次增菌３７℃6-8h1、懸滴動(dòng)力試驗(yàn)（+），動(dòng)力抑制試驗(yàn)（+）2、有明確流行病學(xué)史，動(dòng)力試驗(yàn)（+），動(dòng)力抑制試驗(yàn)（+）癥狀典型但服藥患者便檢驗(yàn)操作程序24霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

菌株的初步鑒定血清凝集試驗(yàn)復(fù)核及鑒定血清凝集試驗(yàn)革蘭氏染色氧化酶試驗(yàn)粘絲試驗(yàn)動(dòng)力試驗(yàn)檢驗(yàn)操作程序25霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

菌株的初步鑒定血清凝集試驗(yàn)挑取可疑菌落與O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗(yàn)，很快出現(xiàn)均勻沙粒樣凝集顆粒為陽(yáng)性（一般不超過10s）注意：菌液渾濁，似凝非凝不能判定為陽(yáng)性同時(shí)做生理鹽水對(duì)照在1min內(nèi)不出現(xiàn)凝集為陰性結(jié)果可疑時(shí)需要做PCR鑒定檢驗(yàn)操作程序26霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

菌株的復(fù)核及分型血清凝集試驗(yàn)用O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清與挑取的菌落進(jìn)行玻片凝集O1群霍亂弧菌分型用小川型和稻葉型單價(jià)血清進(jìn)行玻片凝集結(jié)果分3種情況同時(shí)做生理鹽水對(duì)照檢驗(yàn)操作程序27霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

菌株的復(fù)核及分型氧化酶試驗(yàn)弧菌屬大部分為陽(yáng)性，作為弧菌的簡(jiǎn)易輔助鑒定方法用氧化酶試劑（1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺）濕潤(rùn)濾紙取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落涂抹于有試劑的濾紙上反應(yīng)部位在1~2min內(nèi)出現(xiàn)粉紅-紫紅-紫藍(lán)色判為陽(yáng)性腸桿菌科細(xì)菌不變色或變粉后很快退色注意不使用過期試劑和金屬接種針檢驗(yàn)操作程序28霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

菌株的復(fù)核及分型粘絲試驗(yàn)弧菌屬大部分為陽(yáng)性作為弧菌的簡(jiǎn)易輔助鑒定方法在玻璃平皿上滴一大滴0.5%去氧膽酸鈉溶液取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上新鮮培養(yǎng)物研磨后與試劑研磨混合混懸液變清亮粘稠，可拉出細(xì)長(zhǎng)絲者為陽(yáng)性陰性者呈均勻懸液狀態(tài)動(dòng)力試驗(yàn)革蘭氏染色檢驗(yàn)操作程序29霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

藥敏試驗(yàn)根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的Kirby-Bauer（K-B）氏法進(jìn)行。檢驗(yàn)操作程序菌種接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂37℃16～18h

菌落接種營(yíng)養(yǎng)肉湯37℃4～6h

調(diào)整菌液到0.5麥?zhǔn)蠁挝籑H培養(yǎng)基上涂布菌液貼藥敏紙片游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑

37℃18～24h

30霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

藥敏試驗(yàn)注意事項(xiàng)每次藥敏試驗(yàn)必須用ATCC25922大腸桿菌做質(zhì)控使用的MH培養(yǎng)基不能太薄使用的MH培養(yǎng)基PH值應(yīng)為7.3抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限

不可用過期的試劑和藥敏紙片檢驗(yàn)操作程序31霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

熒光定量PCR方法鑒定探針和引物檢驗(yàn)操作程序SO1FGACTCACCTTCGATTTCAGCAASO1RGAATAACTCAAGGCGATGAAGTGATO1probeFACGGGTAACGCACCACACTGGACTATGPSO139FGCGGTGTAGCGGGTTTTATTAGSO139RTGCATAATACTTTCGACCATGGAO139probeFAAACAGTCGACCGGCGATAAACGCTPSCTXFTTTCATCGCAAGTATTACTCATCGASCTXRAAGAGCCGTGGATTCATCATGCTprobeFAGCATTCCCACAACCCGGCGP32霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

熒光定量PCR方法鑒定模板的制備：挑取數(shù)個(gè)菌落加入裝有100μＬ去離子水的1.5mL管中,混勻后100℃10分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液作為模板。檢驗(yàn)操作程序33霍亂實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

熒光定量PCR方法鑒定反應(yīng)體系的配制(20μＬ體系)

（PemixExTaqTM

TaKaRa

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2×PCR反應(yīng)混合物：10μＬ/份上游引物（10μM）：0.4μＬ/份下游引物（10μM）：0.4μＬ/份

探針（10μmol/Ｌ）：0.4μＬ/份

模板DNA：2μＬ/份

DDw：6.8μＬ/份