3.2基因工程的基本操作程序第1課時課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章

基因工程第二節(jié)

基因工程的基本操作程序基因A基因B基因C非基因片段放大基因的結(jié)構(gòu)真核生物與原核生物基因組成不盡相同。原核生物基因的結(jié)構(gòu)RNA聚合酶識別和結(jié)合位點啟動轉(zhuǎn)錄結(jié)束轉(zhuǎn)錄非編碼區(qū):位于編碼區(qū)的上游和編碼區(qū)的下游

不編碼蛋白質(zhì)，但可以調(diào)控基因的表達編碼區(qū):可轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，編碼蛋白質(zhì)。真核生物基因的結(jié)構(gòu)前體mRNA外顯子外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子內(nèi)含子:編碼區(qū)不編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子:編碼區(qū)編碼蛋白質(zhì)的序列真核生物外顯子內(nèi)含子原核生物筆記P76首端起始密碼子終端終止密碼子非編碼區(qū):不編碼蛋白質(zhì)，但可以調(diào)控基因的表達

編碼區(qū):可編碼蛋白質(zhì)。內(nèi)含子:編碼區(qū)不編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子:編碼區(qū)編碼蛋白質(zhì)的序列筆記P76（2）編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？（1）基因結(jié)構(gòu)中存在哪些非編碼序列？包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子【思考】真核細胞基因更長，因為其編碼區(qū)含內(nèi)含子從社會中來1997年，我國政府首次批準商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益45億元1.你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？2.培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因?qū)肱c載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因的檢測與鑒定Bt基因蘇云金桿菌從社會中來在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因就是目的基因。根據(jù)需求的不同，目的基因也不同，主要指編碼蛋白質(zhì)的基因第一步：目的基因的篩選與獲取一.篩選合適的目的基因1.目的基因2.實例與生物抗逆性相關(guān)的基因與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因與生產(chǎn)藥物相關(guān)的基因與毒物降解相關(guān)的基因與工業(yè)用酶相關(guān)的基因資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。4.方法：從相關(guān)的

和

的基因中進行篩選已知結(jié)構(gòu)功能清晰一.篩選合適的目的基因

*隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能4.方法：從相關(guān)的

和

的基因中進行篩選已知結(jié)構(gòu)功能清晰一.篩選合適的目的基因?qū)嵗禾K云金桿菌的殺蟲作用于Bt基因有關(guān)掌握了Bt基因的序列信息對Bt基因的表達產(chǎn)物——Bt抗蟲蛋白有較為深入的了解蘇云金桿菌制劑可防治棉花蟲害Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因思考：（P77）1.Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理是什么？2.抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白是否會對人畜產(chǎn)生危害？為什么？

當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響二.目的基因的獲取目的基因的獲取方法：人工合成、

PCR擴增、從基因文庫獲取。1.人工合成☆前提：僅適用于較短的目的基因、核苷酸序列已知DNA合成儀用化學(xué)方法合成DNA2.PCR擴增(聚合酶鏈式反應(yīng))PCR儀☆前提：僅適用于較長的目的基因、核苷酸序列已知①基因文庫的構(gòu)建過程

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。②基因文庫類型基因組文庫部分基因文庫（主要是cDNA文庫）3.從基因文庫中直接獲?、诨蛭膸祛愋停?）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當限制酶切割許多DNA片段該生物基因組文庫每個受體菌含有一段不同的DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體?！菊f明】基因文庫中不是直接儲存相應(yīng)基因，而是保存受體菌群，受體菌群中含有基因。基因組文庫含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體。cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成mRNA雜交雙鏈單鏈DNA雙鏈cDNA(cDNA)該生物cDNA文庫基因組文庫中的基因含有啟動子、終止子，cDNA文庫中的基因不含以上結(jié)構(gòu)。與載體連接導(dǎo)入受體菌群逆轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶（2）部分基因文庫的構(gòu)建文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因多少物種間基因交流小大無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以目的基因獲取方法1.人工合成2.利用PCR擴增3.從基因文庫中獲取基因組文庫：含某種生物的全部基因部分基因文庫（如：cDNA文庫）：含某種生物的部分基因筆記1.為從根本上解決水稻中的高植酸問題，可將植酸酶基因?qū)怂?培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種。如下圖是獲取植酸酶基因的流程。據(jù)圖回答下列問題:(1)圖中基因組文庫

(填“小于”“等于”或“大于”)cDNA文庫。(2)通過基因組文庫篩選分離出的目的基因I與圖中通過cDNA文庫篩選分離出的目的基因Ⅱ

(填“相同”或“不同”)。大于不同

先對目的基因進行擴增思考:獲取一個Bt基因之后，是否就該立即開始準備轉(zhuǎn)基因操作？抗蟲基因快速獲得大量抗蟲基因蘇云金桿菌提取

三.利用PCR獲取和擴增目的基因1.PCR的概念PCR是

的縮寫，是一項根據(jù)

的原理，在

提供參與DNA復(fù)制的

與_______，對

進行

的技術(shù)；聚合酶鏈式反應(yīng)DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的核苷酸序列大量復(fù)制

①全稱：______________________________②原理：______________________________③操作環(huán)境：__________________________④目的：______________________________⑤優(yōu)點：______________________________聚合酶鏈式反應(yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制可以特異性的快速擴增目的基因回顧：DNA復(fù)制的過程2.復(fù)制所需的基本條件:參與的組分在DNA復(fù)制中的作用

解旋酶DNA母鏈

合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈

提供DNA復(fù)制的模板斷開氫鍵，打開DNA雙鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶）（體外用高溫代替）4種脫氧核苷酸DNA聚合酶緩沖溶液（含Mg2+）（實際用dNTP）（2種）引物維持反應(yīng)體系pH穩(wěn)定,激活DNA聚合酶dNTP水解能量AGCT4種脫氧核苷酸2.復(fù)制所需的基本條件:dNTP:脫氧核苷三磷酸脫氧含氮堿基三磷酸

腺嘌呤PPP~~脫氧核糖dATPdGTPdCTPdTTP2.復(fù)制所需的基本條件:

鳥嘌呤PPP~~脫氧核糖

胞嘧啶PPP~~脫氧核糖

胸腺嘧啶PPP~~脫氧核糖dATP與ATP有何區(qū)別？脫氧核糖核糖dATPATP

腺嘌呤PPP~~核糖

腺嘌呤PPP~~脫氧核糖dNTP:脫氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）提供能量提供原料筆記水解

含氮堿基PPP~~脫氧核糖思考：體內(nèi)DNA復(fù)制和PCR技術(shù)的能量來源分別是？體內(nèi)DNA復(fù)制時能量來源：PCR技術(shù)能量來源：

由dNTP水解提供能量。解旋：由ATP提供合成子鏈：由dNTP水解提供2.復(fù)制所需的基本條件:參與的組分在DNA復(fù)制中的作用

解旋酶DNA母鏈

合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈

提供DNA復(fù)制的模板斷開氫鍵，打開DNA雙鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶）（體外用高溫代替）4種脫氧核苷酸DNA聚合酶緩沖溶液（含Mg2+）（實際用dNTP）（2種）引物維持反應(yīng)體系pH穩(wěn)定,激活DNA聚合酶3′5′DNA聚合酶3′5′模板鏈子鏈DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′-端，不能直接將單個的核苷酸聚合成鏈PCR擴增需要引物的原因？引物是什么？PCR擴增需要引物的作用？

使耐高溫的DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。引物的本質(zhì)是什么？化學(xué)本質(zhì)：DNA單鏈或RNA單鏈體內(nèi)：引物一般為RNA單鏈體外：引物一般是DNA單鏈或RNA單鏈DNA復(fù)制目的基因DNA①受熱變性后解為單鏈，②引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合；然后以單鏈DNA為模板③在DNA聚合酶作用下進行延伸，即將4種脫氧核苷酸加到引物的3’端，如此重復(fù)循環(huán)多次。每次循環(huán)一般可以分為變性、復(fù)性、延伸三步。3.PCR的過程DNA模板3.PCR的過程AGCT4種脫氧核苷酸引物耐高溫的DNA聚合酶反應(yīng)體系中必須一次性加全所有所需物3.PCR的過程待擴增的DNA片段3′3′3′3′1.變性：溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈3′3′3′3′2.復(fù)性：溫度降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合待擴增的DNA片段1.變性3.PCR的過程AGCT待擴增的DNA片段4種脫氧核苷酸3′3′3′3′3′3′3′3′1.變性2.復(fù)性3.延伸：溫度升至72℃左右，溶液中4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶作用下連接成新的DNA鏈3.PCR的過程3.延伸：耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（DNTP）引物待擴增的DNA片段（模板）5’5’

變性

復(fù)性

延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。過程：3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物。第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)的產(chǎn)物。6.PCR的結(jié)果由于一個循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式擴增（約為

，其中n為擴增循環(huán)的次數(shù)）。指數(shù)2n7.PCR產(chǎn)物的鑒定常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。思考：1.變性過程破壞的是哪種鍵？是否需要酶？2.PCR擴增過程是否需要ATP供能？氫鍵

不需要酶，需要90℃以上的高溫不需要

由dNTP水解供能歸納：思考：3.引物是什么？在復(fù)性過程中引物結(jié)合部位？子鏈延伸的方向？4.耐高溫DNA聚合酶的作用？短單鏈核酸

引物結(jié)合模板鏈的3’端3′3′子鏈從5'端→3'端延伸將單個核苷酸加到引物的3'-端歸納：（1）PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)

（

）（2）PCR擴增技術(shù)中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚

（

）（3）PCR過程使用的DNA聚合酶的特點是耐高溫

（

）（4）PCR技術(shù)中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高

（

）判斷常考語句，澄清易混易錯思考：在利用PCR獲取和擴增目的基因時，至少幾輪循環(huán)才會獲得只含目的基因的片段？第一次循環(huán)90℃以上，DNA雙鏈解開50℃左右，引物與DNA結(jié)合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’第二次循環(huán)3’5’高溫變性、低溫復(fù)性5’3’5’5’3’3’中溫延伸第二次循環(huán)3’5’高溫變性、低溫復(fù)性第三次循環(huán)3’5’中溫延伸第三次循環(huán)3’5’思考：在利用PCR獲取和擴增目的基因時，至少幾輪循環(huán)才能從DNA分子中獲得只含目的基因的片段？至少3輪循環(huán)才會獲得只含目的基因的片段為何放入的是整個模板，卻可以只獲得目的基因引物具有特異性第n次循環(huán)，消耗

個引物相關(guān)計算如果循環(huán)n次，則形成

個DNA分子片段。

則形成

條脫氧核苷酸鏈。如果循環(huán)n次，則共需消耗

個引物。

則共需消耗

對引物。如果循環(huán)n次，含引物的DNA分子片段

。

含2種引物的DNA分子片段

。2n2n+12n2n－12n+1－22n2n－2復(fù)性變性延伸比較PCR擴增技術(shù)和體內(nèi)DNA復(fù)制的異同項目體內(nèi)DNA復(fù)制PCR擴增技術(shù)解旋方式解旋酶催化DNA在

下變性解旋場所細胞內(nèi)PCR擴增儀內(nèi)酶

溫度條件需控制溫度，在

下進行結(jié)果相同點（1）模板：均需要DNA的兩條單鏈作為

；（2）原料：均為4種

；（3）酶：均需

酶高溫作用（細胞核）解旋酶、DNA聚合酶耐高溫的DNA聚合酶較高溫度模板脫氧核苷酸DNA聚合細胞內(nèi)溫和條件完整的DNA分子DNA片段或目的基因用PCR可以擴增mRNA嗎？（P79）mRNA不穩(wěn)定不可以直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增。②設(shè)計引物的依據(jù)是：已知目的基因兩端的核苷酸序列關(guān)于引物那些事兒①使用的兩種引物的序列相同嗎？不相同，目的基因兩端具有不同的核苷酸序列

設(shè)計引物是否需要知道目的基因的序列？設(shè)計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。(1)第1組:

第2組:(2)兩種引物與模板鏈如何配對?引物Ⅰ和引物Ⅱ部分堿基發(fā)生互補配對而失效引物Ⅰ自身部分堿基發(fā)生互補配對而失效引物與模板鏈3'端互補配對設(shè)計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。(3)兩種引物的原則:③引物GC含量要適宜，否則影響復(fù)性溫度①引物自身及兩種引物之間不能互補配對②引物長度適宜設(shè)計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。(4)延伸時需要加入2種引物，原因是：

DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物3'端延伸，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增設(shè)計引物依據(jù)③引物GC含量要適宜，過高復(fù)性溫度也要升高①引物自身及兩種引物之間不能互補配對②引物長度適宜原則已知目的基因兩端的核苷酸序列筆記獲得目的基因后直接轉(zhuǎn)入受體嗎？不是。

游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)

游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復(fù)制，導(dǎo)致子代細胞不再含有目的基因。1.基因表達載體的作用？2.將Bt基因送入受體細胞的載體需要具備什么條件？3.Bt基因在受體細胞中穩(wěn)定存在、遺傳給下一代，并表達和發(fā)揮作用還需有哪些結(jié)構(gòu)？第二步：基因表達載體的構(gòu)建第二步：基因表達載體的構(gòu)建1.基因表達載體的作用：①讓目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代；②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用?！罨虮磉_載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作?；駻基因B基因C非基因片段放大2.基因的結(jié)構(gòu)真核生物與原核生物基因組成不盡相同。原核生物基因的結(jié)構(gòu)RNA聚合酶識別和結(jié)合位點啟動轉(zhuǎn)錄結(jié)束轉(zhuǎn)錄非編碼區(qū):位于編碼區(qū)的上游和編碼區(qū)的下游

不編碼蛋白質(zhì)，但可以調(diào)控基因的表達編碼區(qū):可轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，編碼蛋白質(zhì)。真核生物基因的結(jié)構(gòu)前體mRNA外顯子外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子內(nèi)含子:編碼區(qū)不編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子:編碼區(qū)編碼蛋白質(zhì)的序列真核生物外顯子內(nèi)含子原核生物筆記P76首端起始密碼子終端終止密碼子非編碼區(qū):不編碼蛋白質(zhì)，但可以調(diào)控基因的表達

編碼區(qū):可編碼蛋白質(zhì)。內(nèi)含子:編碼區(qū)不編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子:編碼區(qū)編碼蛋白質(zhì)的序列筆記P76（2）編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？（1）基因結(jié)構(gòu)中存在哪些非編碼序列？包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子【思考】真核細胞基因更長，因為其編碼區(qū)含內(nèi)含子啟動子終止子起始密碼子終止密碼子【區(qū)分兩組概念】位于基因上位于mRNA上翻譯的起始點翻譯的終點啟動轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄本身不轉(zhuǎn)錄編碼氨基酸不編碼氨基酸第二步：基因表達載體的構(gòu)建3.基因表達載體的組成：復(fù)制原點終止子目的基因啟動子標記基因3.基因表達載體的組成有時為了滿足應(yīng)用需要，會在載體上人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動子，當誘導(dǎo)物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達。第二步：基因表達載體的構(gòu)建4.基因表達載體的構(gòu)建過程基因表達載體構(gòu)建模式圖第二步：基因表達載體的構(gòu)建限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標記基因復(fù)制原點質(zhì)粒①首先用

切割載體（質(zhì)粒），使它出現(xiàn)一個切口。限制酶4.基因表達載體的構(gòu)建過程目的基因限制酶切割位點獲取目的基因限制酶限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標記基因復(fù)制原點質(zhì)粒4.基因表達載體的構(gòu)建過程②然后用

限制酶或能產(chǎn)生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。同種相同DNA連接酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因限制酶限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標記基因復(fù)制原點質(zhì)粒4.基因表達載體的構(gòu)建過程③再利用

將目的基因的DNA片段拼接到

的切口處，

這樣就形成了一個重組DNA分子（即：基因表達載體）。DNA連接酶載體重組DNA分子【核心歸納】圖解限制酶的選擇原則4.基因表達載體構(gòu)建過程①單酶切單酶切缺點:質(zhì)粒重新環(huán)化目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒與目的基因反向連接【核心歸納】圖解限制酶的選擇原則abab②雙酶切的優(yōu)點:防止質(zhì)粒重新環(huán)化防止質(zhì)粒與目的基因反向連接防止目的基因自身環(huán)化注意：不能用同尾酶【核心歸納】圖解限制酶的選擇原則（1）不破壞目的基因原則（2）保留標記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點原則（3）確保載體和目的基因出現(xiàn)相同黏性末端原則將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？

這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w細胞（1）基因工程操作程序的核心步驟是目的基因的獲取

（

）（2）基因表達載體中有的含有啟動子和終止密碼子

（

）（3）標記基因不一定是抗生素抗性基因

（

）（4）當誘導(dǎo)物存在時，誘導(dǎo)型啟動子可以激活或抑制目的基因的表達

（

）判斷常考語句，澄清易混易錯1．下列有關(guān)體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)比較的敘述，錯誤的是(

)A．二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端B．二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實現(xiàn)解旋C．體內(nèi)DNA復(fù)制需要能量，PCR反應(yīng)也需要能量D．二者遵循的堿基互補配對原則相同B2．圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯誤的是(

)A．在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB．在酶切過程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標記基因C．若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環(huán)化和反向連接D．導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長D第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因?qū)胧荏w細胞的方法導(dǎo)入植物細胞：花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入動物細胞：顯微注射法導(dǎo)入微生物細胞：Ca2+處理法1.將目的基因?qū)胫参锛毎谌剑簩⒛康幕驅(qū)胧荏w細胞（1）花粉管通道法：我國科學(xué)家獨創(chuàng)操作方式①：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。操作方式②：在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。受體細胞為？受精卵子房花粉柱頭花粉管精子卵細胞胚囊②農(nóng)桿菌特點：a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力；第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）①轉(zhuǎn)化是指目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。②農(nóng)桿菌特點：b.農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上；可轉(zhuǎn)移的DNA第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）可轉(zhuǎn)移的DNA第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞③利用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化的思路：將目的基因插入

中，通過農(nóng)桿菌的

作用，就可以使目的基因_______________Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進入植物細胞④農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程T-DNA目的基因構(gòu)建表達載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌植物細胞將目的基因插入染色體DNA中導(dǎo)入植物細胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物組織培養(yǎng)第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞(1)第一次拼接(2)第二次拼接將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上將含目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上（非人工操作）第一次拼接

第二次拼接農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中涉及的兩次拼接、兩次導(dǎo)入分別是？(3)第一次導(dǎo)入(4)第二次導(dǎo)入將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細胞（非人工操作）第一次導(dǎo)入第二次導(dǎo)入④農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞，并再生成植株；體細胞b.可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等。受精卵受體細胞為？受體細胞為？【說明】隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，利用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞2.將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射法①過程：構(gòu)建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的轉(zhuǎn)基因動物《教材》P82第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞2.將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射法③受體細胞：受精卵受精卵容易表現(xiàn)出全能性《教材》P82第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞3.目的基因?qū)胛⑸锛毎狢a2+處理法（1）受體細胞：常用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌最廣泛。優(yōu)點：①遺傳物質(zhì)少②易培養(yǎng)③繁殖快第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞3.目的基因?qū)胛⑸锛毎狢a2+處理法（2）一般過程：一般先用Ca2+處理大腸桿菌使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)再將重組的基因表達載體導(dǎo)入其中Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性這種細胞稱為感受態(tài)細胞第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞實例：利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物（3）將目的基因?qū)胛⑸锛毎?---Ca2+處理法第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞成熟mRNA相應(yīng)酶剪切內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄序列轉(zhuǎn)錄翻譯真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）多肽鏈前體mRNA蛋白質(zhì)加工如果把一個真核生物的基因?qū)朐思毎斜磉_，一定會產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)嗎？一般不能產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)原因：①原核生物細胞里沒有相應(yīng)的酶來去除內(nèi)含子；②原核生物沒有真核的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）如果把真核基因?qū)朐思毎斜磉_，不考慮蛋白質(zhì)加工的問題，如何產(chǎn)生與原來結(jié)構(gòu)相同的蛋白質(zhì)嗎？成熟mRNA去除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄序列轉(zhuǎn)錄真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）前體mRNA把真核基因的cDNA導(dǎo)入到原核細胞中表達?！究偨Y(jié)】將目的基因?qū)氩煌毎姆椒ǚN類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法

受體細胞

轉(zhuǎn)化過程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA中→表達目的基因表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細胞→重組的基因表達載體導(dǎo)入細胞中農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2＋處理法體細胞或受精卵受精卵原核細胞在棉花細胞中，重組表達