HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)課件

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要內(nèi)容細(xì)胞簡(jiǎn)介1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)2HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)具體方法與步驟3細(xì)胞培養(yǎng)的常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案4細(xì)胞間的操作注意事項(xiàng)5細(xì)胞簡(jiǎn)介細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位1665年英國(guó)學(xué)者RobertHooke，用自制的顯微鏡觀(guān)察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并首次借用拉丁文Cella（小室）詞.細(xì)胞簡(jiǎn)介細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位1983-39德國(guó)植物學(xué)家施萊登和動(dòng)物學(xué)家施旺確立了“細(xì)胞學(xué)說(shuō)”的基本原則1、細(xì)胞是有機(jī)體，動(dòng)植物都是由細(xì)胞發(fā)育來(lái)的2、每個(gè)細(xì)胞都作為一個(gè)相對(duì)的獨(dú)立單位，有自己的“生命”

3、新的細(xì)胞可以通過(guò)老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)藥物篩選基因診療治病機(jī)理組織工程基因診斷試管嬰兒培養(yǎng)細(xì)胞能做什么細(xì)胞的培養(yǎng)具體方法與步驟細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)的含義，簡(jiǎn)單地說(shuō)即是把來(lái)自機(jī)體的組織經(jīng)分散成為單個(gè)細(xì)胞，放在類(lèi)似于體內(nèi)的體外環(huán)境中生存，使其不斷生長(zhǎng)、繁殖或傳代，借以觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、衰老等生命現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)具體方法與步驟原代培養(yǎng)

用直接從機(jī)體獲得的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過(guò)程主要是采用無(wú)菌操作的方法，把組織（或器官）從動(dòng)物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長(zhǎng)和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步。細(xì)胞的培養(yǎng)具體方法與步驟傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化，把細(xì)胞分散成單細(xì)胞再傳代，而懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞則用直接傳代法或離心法傳代。HEK293T和HEK293細(xì)胞HEK293細(xì)胞簡(jiǎn)介HEK293細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)HEK293T和HEK293細(xì)胞HEK293細(xì)胞簡(jiǎn)介HEK293細(xì)胞株是轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人胚腎上皮細(xì)胞，由于容易轉(zhuǎn)染且容易培養(yǎng)，常被用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

HEK293THEK293SV40大T抗原瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染效率更高HEK293T和HEK293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中重組DNA導(dǎo)入感染性強(qiáng)的細(xì)胞系已獲得目的基因暫時(shí)但高水平的表達(dá)。轉(zhuǎn)染的DNA不必整合進(jìn)宿主染色體，當(dāng)用大量的樣品需要在短時(shí)間內(nèi)分析時(shí)，尤其是在轉(zhuǎn)然后的1-4天內(nèi)收獲細(xì)胞，所得的溶解產(chǎn)物用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)，可以采用瞬時(shí)表達(dá)的方式。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染這種細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染的目的基因整合到宿主染色體DNA中并指導(dǎo)適量的目的蛋白的合成。一般來(lái)說(shuō)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率要比瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效率低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。HEK293細(xì)胞HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)條件完全培養(yǎng)基10%的胎牛血清DMEM(4.0mML-谷氨酰胺4500mg/ml葡萄糖)1%雙抗(1000units/Lpenicillin1000mg/Lstreptomycin)37℃5%CO2無(wú)菌技術(shù)制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序（準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的一切用品）洗手和著裝（75%酒精消毒）進(jìn)入超凈臺(tái)中的所有物品均需消毒操作野消毒細(xì)胞培養(yǎng)耗材HEK293細(xì)胞的傳代待細(xì)胞的融合率達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行傳代。棄去舊細(xì)胞液4℃遇冷的DPBS（不含Ca2+、Mg2+）4ml沖洗后棄液加入0.05%（37

℃預(yù)溫

）胰酶消化加入12ml完全培養(yǎng)基（37℃預(yù)溫）將細(xì)胞從細(xì)胞瓶底部沖下1:4傳代即取3ml細(xì)胞懸液加入有9ml完全培養(yǎng)基的新細(xì)胞瓶中

放入37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)HEK293細(xì)胞的傳代加入0.05%胰酶消化1剛加入胰酶細(xì)胞還是致密單層2細(xì)胞開(kāi)始皺縮但不明顯，仍維持細(xì)胞正常形態(tài)3細(xì)胞明顯皺縮變小，細(xì)胞間隙增大不再致密，部分細(xì)胞維持正常形態(tài)，部分細(xì)胞皺縮變圓4細(xì)胞基本皺縮變圓，此時(shí)細(xì)胞吹打可下。5如消化過(guò)頭，會(huì)見(jiàn)到許多細(xì)胞脫落隨棄去的胰酶溶液流失。HEK293細(xì)胞的傳代

HEK293細(xì)胞的凍存隨著傳代的次數(shù)增加，293細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等。所以要在細(xì)胞購(gòu)進(jìn)時(shí)就進(jìn)行大量?jī)龃妫员ＷC實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。原則：慢凍HEK293細(xì)胞的凍存凍存前的準(zhǔn)備DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)：試驗(yàn)前置室溫下。0.05%的胰酶消化液：37℃預(yù)溫。程序凍存盒（加250ml異丙醇）、二甲基亞砜(DMSO)、2ml細(xì)胞凍存管（標(biāo)記細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、日期）、DPBS（不含鈣鎂）HEK293細(xì)胞的凍存凍存前的準(zhǔn)備HEK293細(xì)胞凍存步驟配制細(xì)胞凍存液

取50ml無(wú)菌離心管，于超凈臺(tái)內(nèi)，加入適量DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，再逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置室溫下待用。HEK293細(xì)胞凍存步驟

取準(zhǔn)備凍存的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，以DPBS2-3ml洗細(xì)胞一次加入0.5-1.0ml0.05%的胰酶消化加入新鮮培養(yǎng)基10-12ml吹打成細(xì)胞懸液收集細(xì)胞懸液至50ml無(wú)菌離心管，1000rpm，5min離心.棄上清，加入適量培養(yǎng)基取與細(xì)胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液，DMSO最后濃度為10%HEK293細(xì)胞凍存步驟

細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml（細(xì)胞計(jì)數(shù)），分裝于已標(biāo)示完全之細(xì)胞凍存管中將細(xì)胞凍存管放入程序凍存盒中（已加250ml異丙醇），置-80℃超低溫冰箱第二天將細(xì)胞放入液氮灌，并記錄HEK293細(xì)胞凍存步驟細(xì)胞凍存的注意事項(xiàng)欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高之狀態(tài)冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色，以小體積分裝，4℃避光保存低溫?fù)p傷主要發(fā)生在0℃～-60℃這一溫度區(qū)內(nèi)，這一溫度范圍內(nèi)不宜過(guò)久HEK293細(xì)胞的復(fù)蘇當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多(超過(guò)50代)，細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)或細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時(shí)，需要丟棄并對(duì)開(kāi)始凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇原則：快復(fù)HEK293細(xì)胞的復(fù)蘇復(fù)蘇前的準(zhǔn)備DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)：試驗(yàn)前置室溫下將水浴鍋預(yù)熱至37℃取新培養(yǎng)瓶（75cm2），標(biāo)記細(xì)胞編號(hào)、時(shí)間，加入10mlDMEM培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱)，潤(rùn)濕底面HEK293細(xì)胞復(fù)蘇步驟

根據(jù)凍存記錄從液氮灌中取出凍存的細(xì)胞迅速投入已經(jīng)預(yù)熱至37℃的水浴鍋中，并快速晃動(dòng)，在1-2min內(nèi)使完全融化用酒精擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)，有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶輕輕混勻，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)次日換液細(xì)胞培養(yǎng)的常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案一、細(xì)胞培養(yǎng)污染問(wèn)題二、何時(shí)須更換培養(yǎng)基三、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基四、細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞污染細(xì)胞培養(yǎng)中最大的敵人污染包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成份和造成細(xì)胞不純的異物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)及細(xì)胞細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞污染的原因無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)操作室環(huán)境不佳培養(yǎng)基或者血清的污染細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞的細(xì)菌污染最常見(jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以。革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、假單胞菌等。其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。細(xì)菌污染后，會(huì)很快出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有少數(shù)培養(yǎng)液肉眼觀(guān)察無(wú)多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞的細(xì)菌污染檢測(cè)16SRNAPCR法

細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案常見(jiàn)的細(xì)菌污染白色鏈球菌污染以及革蘭氏染色圖片細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞的真菌污染梅雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。真菌污染后，霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞的真菌污染檢測(cè)鏡檢有絲狀物細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案常見(jiàn)的真菌污染真菌污染霉菌污染細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞的支原體污染細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中被支原體污染是一個(gè)世界性的難題細(xì)胞被支原體污染后，細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變，而細(xì)胞的生長(zhǎng)率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺(jué)。細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞的支原體污染檢測(cè)試劑盒檢測(cè)法：目前已有專(zhuān)門(mén)做支原體檢測(cè)的試劑盒，可以用細(xì)胞滴片進(jìn)行檢測(cè)間接免疫熒光法和免疫印跡：簡(jiǎn)便、快速、特異性細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案常見(jiàn)的支原體污染支原體污染的電鏡下圖片細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞污染的解決方法控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作原則上棄掉加抗生素

污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞污染的解決方法加抗生素細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案何時(shí)需更換細(xì)胞液視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案何時(shí)需更換細(xì)胞液視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基不能，每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活細(xì)胞污染問(wèn)題與解決方案細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。細(xì)胞間的操作注意事項(xiàng)未經(jīng)許可，任何人不得進(jìn)入細(xì)胞間。不得在細(xì)胞間內(nèi)做任何與試驗(yàn)無(wú)關(guān)之事。不得攜帶任何與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)或可能導(dǎo)致污染的物品進(jìn)入細(xì)胞間。必須隨時(shí)保持細(xì)胞間的整潔、衛(wèi)生，及時(shí)清理雜物、垃圾。所有設(shè)備、物品，使用后必須及時(shí)歸位。進(jìn)入細(xì)胞間必須更換細(xì)胞間專(zhuān)用拖鞋與工作服。不得將細(xì)胞間專(zhuān)用拖鞋與工作服傳出細(xì)胞間外。進(jìn)入細(xì)胞間必須養(yǎng)成隨手關(guān)門(mén)習(xí)慣。操作期間，細(xì)胞間外門(mén)和中門(mén)必須處于關(guān)閉狀態(tài)。LOGO細(xì)胞間的操作注意事項(xiàng)操凈工作臺(tái)實(shí)驗(yàn)前和試驗(yàn)后的滅菌，打開(kāi)紫外燈15-20分鐘。試驗(yàn)操作期間，應(yīng)戴手套。并注意隨時(shí)用75%酒精消毒雙手。實(shí)驗(yàn)操作期間，操凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)應(yīng)處于打開(kāi)狀態(tài)。操作結(jié)束后，關(guān)閉擋板、關(guān)閉風(fēng)機(jī)。凡是帶入操凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶等到額瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面。使用倒置顯微鏡前，用75%酒精擦拭消毒載物臺(tái)使用二氧化碳培養(yǎng)箱時(shí)，應(yīng)盡量縮短開(kāi)門(mén)時(shí)間，減少開(kāi)門(mén)次數(shù)。每次倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞后，用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，再放入放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。LOGO細(xì)胞間的操作注意事項(xiàng)每一個(gè)人操作結(jié)束后，必須及時(shí)清理操凈工作臺(tái)內(nèi)的物品，不得在工作臺(tái)內(nèi)留置或堆積雜物。清理操凈工作臺(tái)后，用75%酒精擦拭消毒操凈工作臺(tái)面。每一個(gè)操作結(jié)束后，必須及使用84消毒液消毒管道，并