流式細(xì)胞相關(guān)操作

1型糖尿病藥物療效的流式細(xì)胞儀操作原理：體內(nèi)各T淋巴細(xì)胞亞群相互作用維持著機(jī)體的正常免疫功能,在保護(hù)機(jī)體免受各種病原體感染的過程中起著重要的作用。CD3、CD4、CD8均為隨T細(xì)胞分化過程出現(xiàn)的抗原故又稱T細(xì)胞分化抗原。CD3抗原分布于所有成熟的T細(xì)胞膜上,是所有的T細(xì)胞都具有的分化抗原,也是鑒定外周血中T細(xì)胞的最好標(biāo)志。CD4和CD8亞群是一對相互排斥的分化抗原,正常人CD4+T細(xì)胞約占T細(xì)胞總數(shù)的65%,可分為Thl和Th2兩個亞群。CD4+多為輔助性T細(xì)胞(Th),通常是識別抗原遞呈細(xì)胞外表與MHCⅡ類分子結(jié)合的抗原,具有輔助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能。Thl、Th2細(xì)胞依賴它們產(chǎn)生的細(xì)胞因子還有相互調(diào)節(jié)和制約作用。CD8分子多由抑制性T細(xì)胞(Ts)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表達(dá),是鑒定此兩種細(xì)胞亞群的主要標(biāo)志。Ts細(xì)胞在免疫應(yīng)答中主要起抑制性調(diào)節(jié)作用,通過抑制Th細(xì)胞的活性,抑制抗體形成和細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用。CTL細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性可以殺傷帶有抗原的靶細(xì)胞。CD4/CD8正常機(jī)體為1.5以上。一般認(rèn)為CD4+T細(xì)胞減少,CD4/CD8下降,意味著機(jī)體免疫功能低下。。本實驗主要觀察小鼠脾臟中的Th1、Th2、Treg、Th17細(xì)胞。主要選取的抗體有：CD3，CD4，CD8，F(xiàn)oxp3＋，RoRγt＋，T-bet＋等。流式細(xì)胞分析T細(xì)胞亞型處死各組小鼠，每組3只，取脾臟，遵照相關(guān)流式操作流程處理脾細(xì)胞。，封閉液來自正常小鼠或大鼠血清〔表2.2〕，每組檢測8個不同的指標(biāo)，分別設(shè)為空白對照管、CD4＋管、CD4＋CD25＋管、Foxp3＋單標(biāo)管、Foxp3＋/CD4＋CD25＋管、RoRγt＋/CD4＋管、T-bet＋/CD4＋管和GATA-3＋/CD4＋管〔表2.3〕[6]。Table2.1Propertiesofantibodiesusedinflowcytometricanalysis.HostIsotypeReactivityConjugateCat.No.Anti-CD4RatIgG2b,kappaMouseAPC-eFluor78047-0041-80Anti-CD25RatIgG1,lambdaMousePE12-0251-81Anti-Foxp3RatIgG2a,kappaMouseAlexaFluor48853-5773-80Anti-RoRγtRatIgG1,kappaMousePE12-6981-80Anti-T-betMouseIgG1,kappaMousePE12-5825-80Anti-GATA-3RatIgG2b,kappaHuman,MousePerCP-eFluor71046-9966-41AllsixantibodieswerepurchasedfromeBioscience.Table2.2SerumandantibodiesusedforstainingcorrespondingTcellssubsets.BlockingforFCRCell-surfaceantibodyBlockingfornuclearreceptorNuclearantibodyTregsRatserumCD4，CD25RatserumFoxp3Th17RatserumCD4RatserumRoRγtTh1RatserumCD4MouseserumT-betTh2RatserumCD4RatserumGATA-3Table2.3Subjectsandantibodiesintheminvestigatedinthisstudy.設(shè)定管/組需加抗體空白對照管—CD4＋管+CD4CD4＋CD25＋管+CD4、CD25Foxp3＋單標(biāo)管+Foxp3Foxp3＋/CD4＋CD25＋管+Foxp3、CD4、CD25RoRγt＋/CD4＋管+CD4、RoRγtT-bet＋/CD4＋管+CD4、T-betGATA-3＋/CD4＋管+CD4、GATA-3詳細(xì)步驟如下：1、獲取脾臟，參加5-10mLeBioscience?流式染色緩沖液(eBioscienceCat.No.00-4222)，使用3mL注射器注射心研磨組織。

2、收集經(jīng)研磨獲得的細(xì)胞懸液，共10mL，過濾〔消除細(xì)胞團(tuán)塊和碎片〕至離心管中。3、裂解小鼠脾臟紅細(xì)胞，通常一個脾臟使用5mL裂解液，裂解5分鐘左右，最長不超15min。裂解至溶液透亮后參加2倍以上體積的PBS，終止裂解。4℃，1000rpm離心5min，PBS洗滌一次。4、4℃，1000rpm離心5min，用少量染色緩沖液重懸并計數(shù)和活力分析。5、4℃，1000rpm離心5min，用染色緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。6、封閉FCR介導(dǎo)的非特異性反響：染色之前參加適量的大鼠血清，2-8℃或室溫孵育20min。7、等分細(xì)胞懸液，每管50uL〔2×105-108〕，再補(bǔ)加50uL染色液。8、按照抗體說明書參加適量抗體，輕彈混勻。CD4抗體溶液和CD25抗體溶液參加劑量都為1μL。9、避光，4℃，30min。10、用2mL/管的流式染色液洗，室溫1000rpm離心5min，重復(fù)兩遍。11、最后一次離心后，離心完全棄上清。12、加1mLFoxp3Fixation/permeabilization工作液，渦旋固定細(xì)胞。室溫或四度避光孵育30-60min〔小鼠樣品最長可以四度固定18小時〕。13、每管加2mL1×permeabilizationbuffer。14、1000rpm離心5min，棄上清。15、加100uL1×permeabilizationbuffer重懸細(xì)胞后，參加2uL〔2%〕的大鼠/小鼠血清，室溫孵育15min。Foxp3、RoRγt、GATA-3抗體染色用大鼠血清封閉；T-bet抗體染色用小鼠血清封閉。16、封閉液無需洗去，直接參加稀釋好的熒光標(biāo)記核因子抗體〔用PermeabilizationBuffer工作液進(jìn)行稀釋〕20uL，室溫避光孵育至少30min。本實驗中Foxp3、RoRγt、T-bet、GATA-3抗體分別取0.5μL、1μL、2.5μL、5μL原液。17、2mL1×permeabilizationbuffer洗一次，1000rpm室溫離心5min,棄上清。18、加2mL流式染色液，1000rpm室溫離心5min,棄上清。19、適量流式染色液重懸，即可上機(jī)檢測。同行對照依照上述步驟進(jìn)行。軟件分析