第4章 細胞培養(yǎng)課件

第二篇動物細胞工程第4章細胞培養(yǎng)動物細胞工程單克隆抗體養(yǎng)細胞融合與單克隆抗體細胞培養(yǎng)胚胎工程核移植轉(zhuǎn)基因動物細胞融合與單克隆抗體細胞培養(yǎng)胚胎工程干細胞核移植染色體工程第4章細胞培養(yǎng)4.1培養(yǎng)細胞的生物學(xué)特性第4章細胞培養(yǎng)4.1.1體外培養(yǎng)細胞的類型是否貼壁？？1）貼壁型細胞:附著在某一固相支持物表面才

能生長的細胞。2）懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而

在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。第4章細胞培養(yǎng)貼壁型粘附:是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式?；谡掣教匦裕辜毎c細胞之間相互結(jié)合形成組織，有機體的絕大多數(shù)細胞必須粘附于一固相表面才能生存和生長.培養(yǎng)時：這些細胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于貼壁型細胞。

第4章細胞培養(yǎng)1、成纖維細胞型：胞體呈梭型，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。

2、上皮型細胞：細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。

4、多型細胞型：有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

第4章細胞培養(yǎng)成纖維細胞樣細胞

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細胞心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)胞體梭形或不規(guī)則三角形胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起中有卵圓形核第4章細胞培養(yǎng)成纖維樣細胞第4章細胞培養(yǎng)雞胚胎成纖維細胞

第4章細胞培養(yǎng)成纖維細胞貼壁和擴展過程第4章細胞培養(yǎng)上皮樣細胞第4章細胞培養(yǎng)

血清

Hela高血清低血清

成纖維細胞樣上皮樣細胞

pH

Hela太酸或太堿標(biāo)準(zhǔn)pH

成纖維細胞樣上皮樣細胞

細胞密度

3T3低密度高密度

成纖維細胞樣上皮樣細胞

生長狀態(tài)改變

懸浮或貼附懸浮貼附

圓形成纖維或上皮樣

轉(zhuǎn)化與否未轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后

成纖維樣可成上皮樣培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定

第4章細胞培養(yǎng)3、游走細胞型：

呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。4、多型細胞型：

有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

第4章細胞培養(yǎng)貼壁型細胞附著在某一固相支持物表面才能生長，貼壁后呈現(xiàn)特定的形態(tài)特征。如圖所示的細胞類型稱為

.A:成纖維細胞型B:游走細胞型C:上皮型細胞D:多型細胞型√第4章細胞培養(yǎng)（二）懸浮型：見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。

第4章細胞培養(yǎng)DT40isaBcelllinederivedfromanavianlymphomainachicken.

第4章細胞培養(yǎng)4.1.2培養(yǎng)細胞的生長特點

正常動物細胞培養(yǎng)的典型特征（P39）核型（染色體）正常，表明沒有明顯的基因改變細胞的傳代次數(shù)大約在50代左右，有限的壽命反應(yīng)了細胞的生長調(diào)節(jié)細胞無惡性，表現(xiàn)在將該細胞注入免疫抑制動物不能形成腫瘤；貼壁依賴、接觸抑制和密度抑制表明其增殖受到抑制，當(dāng)細胞在介質(zhì)表面生長至匯合單層時增殖就停止。第4章細胞培養(yǎng)接觸抑制細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（ContactInhibition）。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細胞分裂停止。第4章細胞培養(yǎng)ContactInhibition

dieproducenewcells第4章細胞培養(yǎng)第4章細胞培養(yǎng)4.1.3培養(yǎng)細胞的生長與增殖過程第4章細胞培養(yǎng)1單個細胞的生長過程第4章細胞培養(yǎng)LivingCellDynamics

TheNeuronalCellLine第4章細胞培養(yǎng)2細胞系的生長過程

原代培養(yǎng)傳代期衰退期第4章細胞培養(yǎng)4.1.4培養(yǎng)細胞的遺傳學(xué)特征染色體細胞性別第4章細胞培養(yǎng)核型正常第4章細胞培養(yǎng)第4章細胞培養(yǎng)Barrbody定義：在哺乳動物體細胞核中，除一條X染色體外，其余的X染色體常濃縮成染色較深的染色質(zhì)體，此即為巴氏小體，又稱X小體，通常位于間期核膜邊緣。1949年，美國學(xué)者巴爾（M.L.Barr）等發(fā)現(xiàn)雌貓的神經(jīng)細胞間期核中有一個深染的小體而雄貓卻沒有。在人類，男性細胞核中很少或根本沒有巴氏小體，而女性則有1個。以后研究表明，巴氏小體就是性染色體異固縮的結(jié)果。第4章細胞培養(yǎng)Barrbody巴氏小體------性別鑒定

第4章細胞培養(yǎng)巴氏小體的失活是隨機的

第4章細胞培養(yǎng)4.1.5體內(nèi)外細胞的差異及培養(yǎng)細胞的分化體內(nèi)外細胞的差異培養(yǎng)細胞的分化第4章細胞培養(yǎng)4.2細胞培養(yǎng)液第4章細胞培養(yǎng)4.2.1細胞培養(yǎng)的常用液體水平衡鹽溶液消化液消化酶抑制劑pH調(diào)整液抗生素液谷氨酰胺補充液第4章細胞培養(yǎng)4.2.1細胞培養(yǎng)的常用液體水平衡鹽溶液消化液消化酶抑制劑pH調(diào)整液抗生素液谷氨酰胺補充液原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時也用膠原酶（collagenase）溶液等。第4章細胞培養(yǎng)4.2.1細胞培養(yǎng)的常用液體水平衡鹽溶液消化液消化酶抑制劑pH調(diào)整液抗生素液谷氨酰胺補充液血清抑制胰蛋白酶第4章細胞培養(yǎng)4.2.2

培養(yǎng)基第4章細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基細胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細胞生長的營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細胞用的物質(zhì)，就其本意上講為人工模擬體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，使細胞在此環(huán)境中有生長和繁殖的能力。它是提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。第4章細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基的基本要求

體外培養(yǎng)的細胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿足細胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。

第4章細胞培養(yǎng)無毒、無污染

體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達到無化學(xué)物質(zhì)污染、無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補體）。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。

第4章細胞培養(yǎng)2天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清。

第4章細胞培養(yǎng)血清(serum)

血清種類:主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。牛血清分為小牛血清(calfserum，CS)、胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)

。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新生小牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10-30天的小牛。第4章細胞培養(yǎng)fetalbovineserum，F(xiàn)BSWhenthemediaisneeded,add50-mlofFBSand5-mlofantibioticstooneoftheportions.Thiscompletesthemediaforuse.IneedtodecreasetheconcentrationofFBSinmymedia.Normally,Iuse10%FBSandIwouldliketouse1%.Doesitcauseanyproblemforcellgrowth?第4章細胞培養(yǎng)胎牛血清的有關(guān)問題胎牛血清：（進口血清）要求剖腹取胎制成。國內(nèi)廠家往往不能做到，經(jīng)常把出生2天以內(nèi)采血稱為胎牛血清。第4章細胞培養(yǎng)血清的主要作用

●提供基本營養(yǎng)物質(zhì)●提供激素和各種生長因子●提供結(jié)合蛋白●提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。●對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用：血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。

第4章細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點

●對大多數(shù)細胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）?！裱搴恍毎a(chǎn)生毒性的物質(zhì)第4章細胞培養(yǎng)血清的缺點（續(xù)）●動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大?！袢〔闹锌赡軒胫гw、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實驗失敗或結(jié)果不可靠?！裱宓氖褂檬沟脤嶒灪蜕a(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因藥物蛋白分離純化很難完成?！翊笠?guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構(gòu)成動物細胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。

第4章細胞培養(yǎng)血清的使用使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃水浴鍋處理30分鐘。滅活的目的是滅活血清中的補體和支原體。血清經(jīng)過滅活也會損失一些對細胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，前提是確認血清中不含補體成分。第4章細胞培養(yǎng)血清的儲存儲存條件：血清一般儲存于-20℃，同時應(yīng)避免反復(fù)凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于-20℃，使用前融化。融化時最好現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應(yīng)盡快使用。

第4章細胞培養(yǎng)3合成培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基包括四大類物質(zhì)：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。

第4章細胞培養(yǎng)常用合成培養(yǎng)基(1)MEM細胞培養(yǎng)基系列(2)DMEM細胞培養(yǎng)基系列(3)RPMI-1640細胞培養(yǎng)基系列(4)199細胞培養(yǎng)基系列(5)水解乳蛋白細胞培養(yǎng)基(6)歐氏平衡鹽(7)F-10，F(xiàn)-12細胞培養(yǎng)基系列(8)其它類型細胞培養(yǎng)基第4章細胞培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基

是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基?？赡馨瑐€別蛋白或大量蛋白組分。研制出無血清培養(yǎng)基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標(biāo)。第4章細胞培養(yǎng)關(guān)于動物細胞培養(yǎng)要使用血清，下列說法正確的是

。A:血清使用前必須滅活B:到目前為止，所有動物細胞培養(yǎng)都需要使用血清C:血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，可以用血清來終止胰蛋白酶的消化。D:血清的使用有利于實驗和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化√第4章細胞培養(yǎng)4.3細胞的基本培養(yǎng)技術(shù)第4章細胞培養(yǎng)4.3.1原代培養(yǎng)1取材組織:雞胚鼠胚皮膚和黏膜血細胞內(nèi)臟和實體瘤第4章細胞培養(yǎng)2組織細胞的分離機械法：離心、切割分離、機械分散法消化法：胰酶、EDTA、膠原酶第4章細胞培養(yǎng)3培養(yǎng)方法組織塊培養(yǎng)法單層細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)第4章細胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)視頻第4章細胞培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)法第4章細胞培養(yǎng)雞胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng)

1.

取9-11日齡的雞胚，用酒精消毒，在超凈工作臺內(nèi)，小心取出雞胚，放在培養(yǎng)皿中，除去頭尾、四肢及內(nèi)臟；2.

胚體用含雙抗PBS沖洗2~3次，切成1~2mm3的小塊，然后轉(zhuǎn)入容積適量大小的三角瓶內(nèi)（或試管、燒杯）；3.

按每個雞胚加入約5mL的EDTA-胰酶消化液，在室溫下消化10min；第4章細胞培養(yǎng)雞胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng)（續(xù)）4.

小牛血清終止消化，收集細胞懸液，沒有消化完全的組織塊可再消化一次；5.

收集到的細胞懸液經(jīng)100目過濾篩過濾，1000rpm離心5min，棄上清；6.

細胞沉淀用DMEM培養(yǎng)液重新懸浮，取出少量細胞懸液臺盼藍染色，計算細胞活力；7.

以5×105個/mL的密度接種到培養(yǎng)瓶中（30mL細胞液/雞胚），于38.5℃、5%CO2濃度、飽和濕度條件下培養(yǎng)。第4章細胞培養(yǎng)4.3.2傳代培養(yǎng)當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。

第4章細胞培養(yǎng)貼壁細胞傳代第4章細胞培養(yǎng)貼壁細胞傳代—消化過程圖示

胰酶消化第4章細胞培養(yǎng)懸浮細胞傳代Wave-bioreactor第4章細胞培養(yǎng)懸浮細胞傳代第4章細胞培養(yǎng)雞胚胎成纖維細胞的傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)的細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部時（約2天），即可進行傳代；吸出原培養(yǎng)液，然后用PBS清洗細胞2~3次，盡量除去殘余的血清；3.

加入0.2mL的消化液進行消化，消化程度可在倒置顯微鏡下觀察，一般以細胞突起縮回、細胞間間隙增大、細胞近乎縮成圓形為度；第4章細胞培養(yǎng)雞胚胎成纖維細胞的傳代培養(yǎng)（續(xù)）4.

吸出消化液，加入適量的含小牛血清的培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打培養(yǎng)瓶底部，使經(jīng)消化的細胞脫離瓶底并分散為單個細胞；5.

收集細胞懸液，1000rpm離心5min，去上清；6.

用培養(yǎng)液重新懸浮細胞并計算細胞活力和密度，以5×105個/mL密度（1：3）接種到培養(yǎng)瓶中，于38.5℃、5%CO2濃度、飽和濕度條件下培養(yǎng)。第4章細胞培養(yǎng)4.4細胞系和細胞株的建立第4章細胞培養(yǎng)細胞系和細胞株的種類原代培養(yǎng)細胞系克隆細胞株二倍體細胞遺傳缺陷細胞腫瘤細胞系或株第4章細胞培養(yǎng)

從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株（Substrain）

細胞株第4章細胞培養(yǎng)細胞系正常細胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞才能無限生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養(yǎng)而成（宮頸癌上皮細胞）。此細胞系一直延用至今。第4章細胞培養(yǎng)細胞系或細胞株的命名

HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）

CHO：中國地鼠卵巢細胞（ChineseHamsterOvary）宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立

NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（NationalInstituteofHealth）建立；每3天傳代，每次接種3×105細胞／毫升。

第4章細胞培養(yǎng)CellLinesforTherapeuticProteinManufacturing

第4章細胞培養(yǎng)建立細胞系（細胞株）的要求組織來源細胞生物學(xué)檢測培養(yǎng)條件和方法第4章細胞培養(yǎng)檔案資料及其管理和使用細胞庫：美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收集所(ATCC)歐洲動物細胞庫(ECACC)日本細胞庫(RCB)中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會：中科院上海細胞庫昆明細胞庫武漢細胞庫

第4章細胞培養(yǎng)ATCC:TheAmericanTypeCultureCollection

美國ATCC菌種保藏中心，又稱美國模式菌種收集中心，座落于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營的，非贏利性組織。目前它可以提供以下物品：細胞系（3000種）；細菌和噬菌體（15000種）；動植物病毒（2500種）；原生動物

1200種以及重組物品等。

第4章細胞培養(yǎng)4.5細胞的凍存、復(fù)蘇和運輸為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄