AbMole 膽固醇在EGFR-TKIs耐藥性中的作用及其機(jī)制研究

AbMole|膽固醇在EGFR-TKIs耐藥性中的作用及其機(jī)制研究非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其高發(fā)病率和死亡率使得對(duì)其治療策略的研究顯得尤為重要。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）如吉非替尼和奧希替尼在攜帶EGFR突變的NSCLC患者中展現(xiàn)了顯著的療效，但隨之而來(lái)的獲得性耐藥性問(wèn)題卻極大地限制了這些藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，脂質(zhì)代謝特別是膽固醇代謝在腫瘤耐藥過(guò)程中扮演著重要角色。由中國(guó)藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)院的ZhenzhenPan,KaiWang,XiniaoWang等人在《MolecularCancer》上發(fā)表的名為“CholesterolpromotesEGFR-TKIsresistanceinNSCLCbyinducingEGFR/Src/Erk/SP1signaling-mediatedERRαre-expression”的文章，文章詳細(xì)描述了膽固醇如何通過(guò)誘導(dǎo)EGFR/Src/Erk/SP1信號(hào)通路介導(dǎo)的ERRα重新表達(dá)，從而促進(jìn)NSCLC對(duì)EGFR-TKIs的耐藥性，并探討了潛在的治療策略。實(shí)驗(yàn)中使用的主要細(xì)胞系包括人NSCLC細(xì)胞系PC-9及其耐藥衍生細(xì)胞系PC-9/GR（吉非替尼耐藥）和PC-9/OR（奧希替尼耐藥），以及攜帶EGFRT790M突變的H1975細(xì)胞系。藥物包括吉非替尼、奧希替尼、洛伐他汀、XCT790等。實(shí)驗(yàn)所需試劑如膽固醇、甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）等均購(gòu)自商業(yè)供應(yīng)商。所有細(xì)胞系均在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37°C、5%CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中生長(zhǎng)。對(duì)于藥物處理，細(xì)胞在含有指定濃度藥物的培養(yǎng)基中孵育一定時(shí)間。采用AmplexRed膽固醇檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞質(zhì)和脂質(zhì)筏中的膽固醇含量。同時(shí)，使用菲林染色觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇的分布。通過(guò)Westernblot和RT-qPCR檢測(cè)ERRα、EGFR、Src、Erk等蛋白和基因的表達(dá)水平。利用免疫熒光觀(guān)察EGFR和Src的共定位情況，并通過(guò)免疫共沉淀分析EGFR與Src的相互作用。構(gòu)建ERRα啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，評(píng)估不同處理對(duì)ERRα啟動(dòng)子活性的影響。研究首先通過(guò)長(zhǎng)期暴露PC-9細(xì)胞于吉非替尼和奧希替尼，成功建立了吉非替尼耐藥細(xì)胞系PC-9/GR和奧希替尼耐藥細(xì)胞系PC-9/OR。利用AmplexRed膽固醇檢測(cè)試劑盒和菲林染色發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞系中總膽固醇和脂質(zhì)筏膽固醇含量均顯著高于親本PC-9細(xì)胞（圖1e-g）。進(jìn)一步通過(guò)MβCD去除膽固醇后，耐藥細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性顯著增加，而補(bǔ)充膽固醇則抵消了MβCD的作用（圖1h-l）。這些結(jié)果表明，膽固醇積累在EGFR-TKIs耐藥過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。ERRα的重新表達(dá)與EGFR-TKIs耐藥性圖1膽固醇在脂質(zhì)筏中的積累是導(dǎo)致EGFR-TKIs抵抗的原因。通過(guò)RT-qPCR、Westernblot和IHC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞系PC-9/GR、H1975和PC-9/OR中ERRα的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于親本PC-9細(xì)胞（圖2a-c）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，MβCD處理可顯著降低ERRα的表達(dá)，而補(bǔ)充膽固醇則可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（圖2d,e）。這些結(jié)果提示，膽固醇可能通過(guò)上調(diào)ERRα的表達(dá)促進(jìn)EGFR-TKIs的耐藥性。圖2膽固醇介導(dǎo)的ERRα過(guò)表達(dá)是EGFR-TKIs耐藥的原因。研究發(fā)現(xiàn)，盡管EGFR-TKIs能夠顯著抑制敏感細(xì)胞系PC-9中EGFR的磷酸化水平，但在耐藥細(xì)胞系PC-9/GR、H1975和PC-9/OR中，EGFR的磷酸化水平并未受到明顯影響（圖3a）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，抑制EGFR、Src或Erk的活性可顯著降低ERRα的表達(dá)（圖4a,b）。通過(guò)免疫共沉淀和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞中EGFR與Src在脂質(zhì)筏中的共定位顯著增加，而MβCD處理可減少這種共定位（圖4g,h,i）。這些結(jié)果表明，EGFR/Src/Erk信號(hào)通路的重新激活在膽固醇介導(dǎo)的ERRα重新表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。圖3EGFR激活維持ERRα再表達(dá)。圖4膽固醇誘導(dǎo)的EGFR/Src/Erk信號(hào)再激活維持ERRα再表達(dá)。利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，SP1是ERRα的潛在轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)CHIP分析發(fā)現(xiàn)，SP1能夠直接結(jié)合到ERRα啟動(dòng)子區(qū)域，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄（圖5j,k）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，抑制SP1的活性可顯著降低ERRα的表達(dá)水平，而過(guò)表達(dá)SP1則可上調(diào)ERRα的表達(dá)（圖5a,b,c）。此外，EGFR/Src/Erk信號(hào)通路的抑制可阻止SP1的核轉(zhuǎn)位（圖5d,e），從而間接抑制ERRα的轉(zhuǎn)錄。圖5SP1直接轉(zhuǎn)錄ERRα，膽固醇/EGFR/Src/Erk軸調(diào)節(jié)SP1核易位。為了探索降低膽固醇和抑制ERRα表達(dá)在治療EGFR-TKIs耐藥性中的潛力，研究進(jìn)一步評(píng)估了洛伐他?。ㄒ环N降低膽固醇的藥物）和XCT790（一種ERRα拮抗劑）的效果。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明，洛伐他汀與吉非替尼或奧希替尼聯(lián)用可顯著抑制耐藥細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期（圖6a,b,c）。體內(nèi)異種移植瘤模型進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論（圖6d-j）。值得注意的是，洛伐他汀的敏化作用可被膽固醇或甲羥戊酸（膽固醇生物合成的前體）所逆轉(zhuǎn)，但XCT790的加入則不受此影響，表明洛伐他汀的敏化作用依賴(lài)于ERRα的抑制。圖6洛伐他汀和ERRα反向激動(dòng)劑可增強(qiáng)EGFR-TKI的敏感性。本研究揭示了膽固醇在EGFR-TKIs耐藥性中的重要作用及其分子機(jī)制。通過(guò)長(zhǎng)期暴露于EGFR-TKIs，NSCLC細(xì)胞積累了大量膽固醇并在脂質(zhì)筏中形成平臺(tái)以促進(jìn)EGFR與Src的相互作用和EGFR/Src/Erk信號(hào)通路的重新激活。這一過(guò)程中，SP1作為ERRα的轉(zhuǎn)錄因子被激活并促進(jìn)ERRα的重新表達(dá)。ERRα通過(guò)調(diào)節(jié)ROS解毒過(guò)程維持耐藥細(xì)胞的生存并抵抗EGFR-TKIs的殺傷作用。洛伐他汀通