AbMole 膽固醇在EGFR-TKIs耐藥性中的作用及其機制研究

AbMole|膽固醇在EGFR-TKIs耐藥性中的作用及其機制研究非小細胞肺癌（NSCLC）是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其高發(fā)病率和死亡率使得對其治療策略的研究顯得尤為重要。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）如吉非替尼和奧希替尼在攜帶EGFR突變的NSCLC患者中展現(xiàn)了顯著的療效，但隨之而來的獲得性耐藥性問題卻極大地限制了這些藥物的長期應用。近年來，越來越多的研究表明，脂質(zhì)代謝特別是膽固醇代謝在腫瘤耐藥過程中扮演著重要角色。由中國藥科大學基礎醫(yī)學與臨床藥學院的ZhenzhenPan,KaiWang,XiniaoWang等人在《MolecularCancer》上發(fā)表的名為“CholesterolpromotesEGFR-TKIsresistanceinNSCLCbyinducingEGFR/Src/Erk/SP1signaling-mediatedERRαre-expression”的文章，文章詳細描述了膽固醇如何通過誘導EGFR/Src/Erk/SP1信號通路介導的ERRα重新表達，從而促進NSCLC對EGFR-TKIs的耐藥性，并探討了潛在的治療策略。實驗中使用的主要細胞系包括人NSCLC細胞系PC-9及其耐藥衍生細胞系PC-9/GR（吉非替尼耐藥）和PC-9/OR（奧希替尼耐藥），以及攜帶EGFRT790M突變的H1975細胞系。藥物包括吉非替尼、奧希替尼、洛伐他汀、XCT790等。實驗所需試劑如膽固醇、甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）等均購自商業(yè)供應商。所有細胞系均在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37°C、5%CO2的濕潤環(huán)境中生長。對于藥物處理，細胞在含有指定濃度藥物的培養(yǎng)基中孵育一定時間。采用AmplexRed膽固醇檢測試劑盒測定細胞質(zhì)和脂質(zhì)筏中的膽固醇含量。同時，使用菲林染色觀察細胞內(nèi)游離膽固醇的分布。通過Westernblot和RT-qPCR檢測ERRα、EGFR、Src、Erk等蛋白和基因的表達水平。利用免疫熒光觀察EGFR和Src的共定位情況，并通過免疫共沉淀分析EGFR與Src的相互作用。構建ERRα啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告基因質(zhì)粒，評估不同處理對ERRα啟動子活性的影響。研究首先通過長期暴露PC-9細胞于吉非替尼和奧希替尼，成功建立了吉非替尼耐藥細胞系PC-9/GR和奧希替尼耐藥細胞系PC-9/OR。利用AmplexRed膽固醇檢測試劑盒和菲林染色發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞系中總膽固醇和脂質(zhì)筏膽固醇含量均顯著高于親本PC-9細胞（圖1e-g）。進一步通過MβCD去除膽固醇后，耐藥細胞對EGFR-TKIs的敏感性顯著增加，而補充膽固醇則抵消了MβCD的作用（圖1h-l）。這些結果表明，膽固醇積累在EGFR-TKIs耐藥過程中發(fā)揮了關鍵作用。ERRα的重新表達與EGFR-TKIs耐藥性圖1膽固醇在脂質(zhì)筏中的積累是導致EGFR-TKIs抵抗的原因。通過RT-qPCR、Westernblot和IHC實驗發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞系PC-9/GR、H1975和PC-9/OR中ERRα的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于親本PC-9細胞（圖2a-c）。進一步實驗表明，MβCD處理可顯著降低ERRα的表達，而補充膽固醇則可逆轉這一效應（圖2d,e）。這些結果提示，膽固醇可能通過上調(diào)ERRα的表達促進EGFR-TKIs的耐藥性。圖2膽固醇介導的ERRα過表達是EGFR-TKIs耐藥的原因。研究發(fā)現(xiàn)，盡管EGFR-TKIs能夠顯著抑制敏感細胞系PC-9中EGFR的磷酸化水平，但在耐藥細胞系PC-9/GR、H1975和PC-9/OR中，EGFR的磷酸化水平并未受到明顯影響（圖3a）。進一步實驗表明，抑制EGFR、Src或Erk的活性可顯著降低ERRα的表達（圖4a,b）。通過免疫共沉淀和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞中EGFR與Src在脂質(zhì)筏中的共定位顯著增加，而MβCD處理可減少這種共定位（圖4g,h,i）。這些結果表明，EGFR/Src/Erk信號通路的重新激活在膽固醇介導的ERRα重新表達過程中發(fā)揮了關鍵作用。圖3EGFR激活維持ERRα再表達。圖4膽固醇誘導的EGFR/Src/Erk信號再激活維持ERRα再表達。利用生物信息學工具預測并結合實驗驗證發(fā)現(xiàn)，SP1是ERRα的潛在轉錄因子。通過CHIP分析發(fā)現(xiàn)，SP1能夠直接結合到ERRα啟動子區(qū)域，并促進其轉錄（圖5j,k）。進一步實驗表明，抑制SP1的活性可顯著降低ERRα的表達水平，而過表達SP1則可上調(diào)ERRα的表達（圖5a,b,c）。此外，EGFR/Src/Erk信號通路的抑制可阻止SP1的核轉位（圖5d,e），從而間接抑制ERRα的轉錄。圖5SP1直接轉錄ERRα，膽固醇/EGFR/Src/Erk軸調(diào)節(jié)SP1核易位。為了探索降低膽固醇和抑制ERRα表達在治療EGFR-TKIs耐藥性中的潛力，研究進一步評估了洛伐他?。ㄒ环N降低膽固醇的藥物）和XCT790（一種ERRα拮抗劑）的效果。體內(nèi)外實驗均表明，洛伐他汀與吉非替尼或奧希替尼聯(lián)用可顯著抑制耐藥細胞的增殖并誘導細胞周期停滯在G0/G1期（圖6a,b,c）。體內(nèi)異種移植瘤模型進一步證實了這一結論（圖6d-j）。值得注意的是，洛伐他汀的敏化作用可被膽固醇或甲羥戊酸（膽固醇生物合成的前體）所逆轉，但XCT790的加入則不受此影響，表明洛伐他汀的敏化作用依賴于ERRα的抑制。圖6洛伐他汀和ERRα反向激動劑可增強EGFR-TKI的敏感性。本研究揭示了膽固醇在EGFR-TKIs耐藥性中的重要作用及其分子機制。通過長期暴露于EGFR-TKIs，NSCLC細胞積累了大量膽固醇并在脂質(zhì)筏中形成平臺以促進EGFR與Src的相互作用和EGFR/Src/Erk信號通路的重新激活。這一過程中，SP1作為ERRα的轉錄因子被激活并促進ERRα的重新表達。ERRα通過調(diào)節(jié)ROS解毒過程維持耐藥細胞的生存并抵抗EGFR-TKIs的殺傷作用。洛伐他汀通