DB51-T 2964-2022 口岸松材線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

DB51Technicalstandardformonitoringthepinewoodnem四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 3 3 3 3 4 6 6 7 本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件起草單位：成都海關(guān)技術(shù)中心、寧波海關(guān)技術(shù)中1口岸松材線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范驗(yàn)室檢測(cè)、監(jiān)測(cè)樣品的保存及處理、監(jiān)測(cè)結(jié)果GB/T23476-2009松材線蟲(chóng)病檢疫技GB/T23478松材線蟲(chóng)普查監(jiān)測(cè)SN/T1724-2006進(jìn)境針葉樹(shù)原木、木制品和木質(zhì)包裝材料中松材線蟲(chóng)的檢SN/T4350-2015旅客攜帶物和郵寄物檢疫鑒定學(xué)名：Bursaphelenchusxylophilus(寄生滑刃亞科（Parasitaphelenchinae傘滑刃屬（Bursaphelenchus能引起松樹(shù)萎蔫病，是針葉樹(shù)木上最重要的病原生物之一。松材線蟲(chóng)相關(guān)信息參松褐天牛MonochamusalternatusHope,18432又名松墨天牛、松天牛，屬于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛屬（Monochamus），是為害松樹(shù)云杉花墨天牛MonochamussaltuariusGebler,1830又名云杉花黑天牛，屬于天?？疲–erambycidae）、墨天牛屬（Monochamus），是一種蛀干性昆松木及其制品pinewoodandwoodenw木質(zhì)包裝材料woodpackingma色物將胞壁染色，促使木材藍(lán)變的現(xiàn)象。藍(lán)變是判斷松材線蟲(chóng)監(jiān)測(cè)抽樣的一個(gè)重海關(guān)指定監(jiān)管場(chǎng)地customsdesignatedsupervisio高風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)植物及其產(chǎn)品實(shí)施查驗(yàn)、檢驗(yàn)、檢海關(guān)監(jiān)管貨物cargounderc減免稅貨物，以及暫時(shí)進(jìn)出口貨物、保稅貨物和34監(jiān)測(cè)范圍墊材料、運(yùn)輸工具、郵寄物及旅客攜帶物。松材線蟲(chóng)的寄主植物范圍參見(jiàn)附錄A.牙以及中國(guó)臺(tái)灣等國(guó)家或地區(qū)的松木及其制品、郵寄物及旅客攜重點(diǎn)抽取材質(zhì)干燥無(wú)松脂香味、有藍(lán)變、有媒樣品標(biāo)識(shí)信息應(yīng)完整、清晰，確?？伤菰?、可追查，規(guī)范填寫附錄表B4誘捕時(shí)間一般為每年的4月下旬至10月底（不同地區(qū)有差異），即松墨天牛成蟲(chóng)羽化初期開(kāi)始，直誘捕器下端離地面1.5m～2.0m。誘捕器上下兩端應(yīng)用鐵絲綁牢并固定，正確添加或更換引誘劑，應(yīng)注照GB/T23476-2009中附錄C執(zhí)行。分離時(shí)室內(nèi)溫度應(yīng)保持在20℃~30℃之間，或置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)置體視顯微鏡下鏡檢（放大倍率10X～20X為宜）。媒介昆蟲(chóng)樣品的分離分離線蟲(chóng)，也可直接浸泡于加水的表面皿或培養(yǎng)皿中，2h后在體視顯微鏡下直接觀察是否有線蟲(chóng)。以避免漏檢），轉(zhuǎn)移到載玻片上，液滴體積50μL左右為宜。在酒精燈上以1s左右的頻率通過(guò)8次~10次，使線蟲(chóng)恰好被殺死為宜。加蓋玻片，制成臨時(shí)玻片。若分離的線蟲(chóng)均為幼蟲(chóng)或數(shù)量極少影響后球、尾部，尤其注意雌蟲(chóng)陰門區(qū)以及雄蟲(chóng)交合刺，并拍攝顯微照片。一般在40倍物鏡下，拍攝雌蟲(chóng)頭5部、陰門區(qū)、尾部各1張照片，拍攝雄蟲(chóng)頭部和尾部各1張照片，必要時(shí)在100倍油鏡下拍攝。顯微鏡配測(cè)量并計(jì)算體長(zhǎng)/蟲(chóng)體最寬處體寬（a）、體長(zhǎng)/尾長(zhǎng)（c）、尾長(zhǎng)/肛門處體寬（c’）等值。如樣品足夠，應(yīng)測(cè)量雄蟲(chóng)、雄蟲(chóng)各20條以上。測(cè)計(jì)方法參考SN/T27松材線蟲(chóng)特異PCR檢測(cè)見(jiàn)附錄E，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)見(jiàn)附錄F，DNA條形碼鑒定見(jiàn)復(fù)核提供復(fù)核的材料為具松材線蟲(chóng)雌雄成蟲(chóng)的線蟲(chóng)分離液9監(jiān)測(cè)樣品的保存及處理6），7A.1發(fā)現(xiàn)歷史和背景松材線蟲(chóng)最早于1929年從美國(guó)德克薩斯州的長(zhǎng)葉松（Pinuspalustris）木材中分離到，被描述為樹(shù)枯死的記錄，損失巨大，但長(zhǎng)期未找到病因。直到1971年等確認(rèn)其為異名，松材線蟲(chóng)從此被定名為Bursaphe1970。A.2地理分布美國(guó)、加拿大、墨西哥、日本、韓國(guó)、西班牙、葡萄A.3侵染循環(huán)松材線蟲(chóng)通過(guò)墨天牛屬（Monochamus）昆蟲(chóng)在寄主植物間傳播。天牛蛹中羽化后即將離開(kāi)寄主樹(shù)通過(guò)傷口進(jìn)入松樹(shù)后，立即轉(zhuǎn)為繁殖階段，4d～5d即可發(fā)育為成蟲(chóng)。松材線蟲(chóng)利用天牛的發(fā)育過(guò)程，通過(guò)取食和產(chǎn)卵這兩種途徑，傳播到新的寄A.4傳播途徑8本松材線蟲(chóng)的傳播媒介為松褐天牛（M.alternatus）、云杉花墨天牛（M.saltuarius），北美洲為卡羅來(lái)納墨天牛（M.carolinensis），葡萄牙為樟子松墨天牛（M.galloprovincialis）。天?？破渌鼘偌扒食崮繕?shù)加工成的木質(zhì)包裝材料中經(jīng)常被截獲。因此，松材線蟲(chóng)A.5松材線蟲(chóng)生活史段。在25℃的有利條件下，松材線蟲(chóng)從卵開(kāi)始，經(jīng)過(guò)4個(gè)繁殖階段的幼蟲(chóng)齡期（J1至J4），在4蟲(chóng)在腸道細(xì)胞中積累脂肪，可在干旱、低溫或營(yíng)養(yǎng)缺乏的逆境下存活。通常該齡幼蟲(chóng)蛻皮成為分散型4齡幼蟲(chóng)JIV（持久型幼蟲(chóng)），再由媒介甲蟲(chóng)傳播給新的樹(shù)木。然而，如果條件變得適合線蟲(chóng)發(fā)育，例如將分散型3齡幼蟲(chóng)JⅢ接種到真菌培養(yǎng)皿中，線蟲(chóng)會(huì)發(fā)育成為繁殖型4齡幼蟲(chóng)J松材線蟲(chóng)的寄主主要是松屬（Pinusspp.）針葉木，我國(guó)寄主主要加拿大云杉（P.canadensis）、北美云杉（P.pungens）、歐洲落葉松（Larixeuropaea）、美加落葉松松屬以外的寄主很少在感染松材線蟲(chóng)后死亡。目前僅美國(guó)報(bào)道藍(lán)杉（Piceapungens）和花旗松（Pseudotsugamenziesii）感染松材線A.7松材線蟲(chóng)雌蟲(chóng)尾形變化綜述然而，這不是絕對(duì)的。許多學(xué)者的研究證實(shí)的占77%（其中圓尾型占44%超過(guò)1μm（1.46μm～3.41μm）的占23%。2005年，趙文霞等報(bào)道到黑松后重新分離，4.2%雌蟲(chóng)有尾尖突；接種到油松上，15%雌蟲(chóng)有尾尖突，但未測(cè)量尾尖突長(zhǎng)度。尖突，平均長(zhǎng)度約為1.7μm，最長(zhǎng)達(dá)2.9μm。但該線蟲(chóng)經(jīng)灰葡萄孢培養(yǎng)后，所有雌蟲(chóng)尾均寬圓，無(wú)尾度為0.5μm～1.2μm，較本文的群體更短。2011年，顧建鋒等報(bào)道了一種美國(guó)木質(zhì)包裝中截獲的松材線蟲(chóng)，從木質(zhì)包裝中直接分離獲得的雌蟲(chóng)約一半尾端寬圓，無(wú)尾尖突；其余則有很短的尾尖突，約0.5μm～1μm。但經(jīng)過(guò)灰葡萄孢人工培養(yǎng)一月后，超過(guò)一半雌蟲(chóng)有1μm～2μm的尾尖突，另有大約10%的雌蟲(chóng)尾尖突為2μm～2.4μm，其余雌蟲(chóng)則無(wú)尾尖突或小于0.5μm。2020年，顧建鋒等從遼寧紅松分離9到一種具明顯尾尖突的松材線蟲(chóng)，其雌蟲(chóng)尾末部分均有或長(zhǎng)或短的尾尖突，末端鈍圓或銳尖，長(zhǎng)1.8松材線蟲(chóng)雌蟲(chóng)均有尾尖突、或者尾尖突長(zhǎng)度超過(guò)2μm的情況是比較罕見(jiàn)的，從實(shí)驗(yàn)室對(duì)上千批次松材末端寬圓，無(wú)尾尖突。群體內(nèi)一些雌蟲(chóng)有短尾尖突，但長(zhǎng)度不超過(guò)2μm。并且，通常群體內(nèi)總能發(fā)現(xiàn)號(hào)【檢查時(shí)間】具體到年月日；——偽傘滑刃線蟲(chóng)B.fraudulentusRühm，1956（J.B.Goodey，1960）——擬松材線蟲(chóng)B.mucronatu——灰黃錦天牛傘滑刃線蟲(chóng)B.luxurio——楊傘滑刃線蟲(chóng)B.populiTomalak&Filipiak，2010——擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲(chóng)B.paraluxuriosaeGu,Wang,Braasch,2012——日本冷杉傘滑刃線蟲(chóng)B.firmaeKanzaki,Maehara,Aikawa&Matsumato,2012——韓國(guó)傘滑刃線蟲(chóng)B.koreanusGu,Wang&Chen,2013——吉拉尼傘滑刃線蟲(chóng)B.gillaniiSch?nfeld,Braasch,Riedel&Gu,2013——錦天牛屬傘滑刃線蟲(chóng)B.acaloleptaeKanzaki,Ekino,Maehara,Aikawa&Giblin-Davis,20松材線蟲(chóng)組線蟲(chóng)均具有以下共同鑒定特征：側(cè)線4條；典型的雄蟲(chóng)交合刺形狀（較長(zhǎng)、弓形，喙突明顯，遠(yuǎn)端一般有盤狀突：均與松材線蟲(chóng)交合刺形態(tài)相似）；尾乳突7個(gè)，P4明顯，P3和P4鄰近且位于交合傘起始處；雌蟲(chóng)陰門蓋較長(zhǎng)（圖C.1）。上述特征中，由于側(cè)線和尾乳突特征有時(shí)在光學(xué)顯微鏡下）；注：A.持久型幼蟲(chóng)；B.繁殖型幼蟲(chóng)；C.雌蟲(chóng)；D.雄蟲(chóng)；E.繁殖型幼蟲(chóng)體前端；F.雌蟲(chóng)陰門區(qū)；G.繁殖型幼蟲(chóng)尾部；注：該群體為紅松中分離到的松材線蟲(chóng)，其雌蟲(chóng)3%，其余絕大部分均有或長(zhǎng)或短的尾尖突，末端鈍圓或銳尖，長(zhǎng)1.8μm±0.7μm(0.3μm～3.2葡萄孢人工培養(yǎng)后，所有的雌蟲(chóng)尾端鈍圓，均無(wú)尾尖突。A～N.直接從紅松樣品分離到的松材線蟲(chóng)雌蟲(chóng)尾形；圖D.4遼寧紅松中分離到的松材線蟲(chóng)注：A.體前部；B.中食道球區(qū)；C、E.雄蟲(chóng)尾部；D.雌蟲(chóng)陰門區(qū)；F～I(xiàn).雌蟲(chóng)尾部。松材線蟲(chóng)M型株系雌蟲(chóng)具有長(zhǎng)約2.2μm～3.0μm的尾尖突，且經(jīng)人工培養(yǎng)后仍如此。而松材線蟲(chóng)R型株系盡管有些個(gè)體會(huì)有短尾尖突，甚至有些群體大部分都有尾尖突，但尾尖突一般在人工培養(yǎng)后消失。目前M型松材線蟲(chóng)僅分布于北美，其寄主主要是注：A.頭部；B.交合傘及尾乳突；C-D、F-GABDCABDCEFHGEFHGJILKJILK注：A-B.陰門；C.交合刺；D.交合傘；E-H.培養(yǎng)后雌蟲(chóng)尾部；I-L.原木中分注：A、B.頭部；C.雌蟲(chóng)陰門蓋；D.雌蟲(chóng)陰門至尾末端；E-F.培養(yǎng)后的雌蟲(chóng)尾部形態(tài)；G.木質(zhì)包裝中直接分離的雌μLPCR管中（含8μLddH2O和1μL10×PCR）），），加熱10min，即得到線蟲(chóng)DNA模板。得到的DNA提取液可直X-FX-R222ddH2O以松材線蟲(chóng)DNA模板作為陽(yáng)性對(duì)照，以不含松材線蟲(chóng)的DNA模板作為陰性對(duì)照，以ddH2O作為空V/cm～5V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度電泳，約0.5h，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)上拍照并保留結(jié)果。采用X-F/X-R引物對(duì)擴(kuò)增后，電泳檢測(cè)得到與陽(yáng)性對(duì)照一致的560bp左右大小的特有條帶J10-1/J10-2Rc引物對(duì)得到160bp左右大小的特有條帶，判定結(jié)果為陽(yáng)性；否則判定結(jié)果為陰性。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)每次檢測(cè)設(shè)立3個(gè)對(duì)照，分別為：含有松材線蟲(chóng)DNA的陽(yáng)性對(duì)照，2212ddH2O熒光信號(hào)的收集條件應(yīng)與探針的熒光基團(tuán)一致，具體設(shè)置方法參照相應(yīng)熒光P應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整基線范圍。閾值設(shè)置原則以基線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct 該引物正常的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為800bp左右，若樣品PCR擴(kuò)增獲得正），使用Chormas軟件或其他序列分析軟件，對(duì)28S基因測(cè)序得到的雙向峰圖文件（后綴名.ab）進(jìn)行拼接。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，去除測(cè)序結(jié)果兩端峰形雜亂的低質(zhì)量序列，并去除引物所在序列區(qū)域，獲得相應(yīng)的DNA序列。拼接完成后，DNA序列方向應(yīng)與PCR擴(kuò)增正（/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)。在BasicBLAST中選擇nucleotideblast，在Enter（Per.Ident）。在BLAST結(jié)果中查看序列相似性最高若待測(cè)樣品序列與已知的松材線蟲(chóng)序列（AY508107.1、EF446929.1-EF446933.1、EF446935.1、AM396580.1等）相似性（Per.Ident值）達(dá)98.98%以上，與其他種類的相似性材線蟲(chóng)陽(yáng)性。若待測(cè)樣品序列與已知的松材線蟲(chóng)相似性低于98.98%如BLAST結(jié)果所顯示的線蟲(chóng)不是傘滑刃屬線蟲(chóng)，甚至不是線蟲(chóng)，很可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于操作不[1]顧建鋒,王江嶺.傘滑刃屬線蟲(chóng)形態(tài)和分子鑒定圖譜[M].廈門大學(xué)出版社,2011.[2]劉偉,楊寶君.松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)雄蟲(chóng)交合傘形狀的比較[J].林業(yè)科學(xué)研究,1995,10(2):223-225.[3]夏永剛,王明旭,張玉榮,等.臨湘市具尾尖突松材線蟲(chóng)病病原的鑒定及病源分析[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009.[4]趙文霞,楊寶君.松材線蟲(chóng)雌蟲(chóng)尾部形態(tài)和寄主的關(guān)系[J].林業(yè)科學(xué)研究,2005,18(3):362-363.[5]鄭煒,顧建鋒,吳昊,等.寧波馬尾松中松材線蟲(chóng)形態(tài)變異研究[J].浙江林業(yè)科技,2007(03):38-40.[6]BraaschH,BurgermeisterW,GuJ.Revisedintragener(Nematoda:Aphelenchoididae).JournalofNematodeMorphologyandSystematics,2009,12:65-88.[7]KiyoharaT,TogushigeY.Inoculationexperimentsofanematode,Bursaphelenchussp.trees[J].NihonRingakkaiShi/JournaloftheJapaneseForestrySociety,1971,53(7):105-114.[8]Mamiya,Yasuharu,Enda,Nobuo.TransmissionofBursaphelenchusLignicolus(Nematoda:Aphelenchoididae)ByMonochamusAlternatus(Coleoptera:Cer