實驗三__顯微鏡油鏡的使用及細(xì)菌形態(tài)觀察.ppt

1、a,1,實驗三 油鏡使用和細(xì)菌形態(tài)觀察,1、顯微鏡油鏡的使用 2、細(xì)菌形態(tài)的觀察（示教） 3、革蘭氏染色 4、芽胞染色,a,2,一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和油鏡的使用技術(shù)及維護的基本知識,（一）顯微鏡油鏡的使用,a,3,二、顯微鏡及油鏡使用原理,顯微鏡的構(gòu)造 1.光學(xué)部分目鏡 、 物鏡 、 照明裝置(聚光鏡、 虹彩光圈、 反光鏡等)。它使檢視物放大,生成物象。,a,4,2.機械部分:鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、載物臺轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件.它起著支持、調(diào)節(jié)、 固定等作用.,a,5,圖1-1-2 光學(xué)顯微鏡的成像原理,a,6,顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率 1.放

2、大倍數(shù)：物鏡放大倍數(shù)目鏡放大倍數(shù) 2. 顯微鏡的分辨率:是表示顯微鏡辨析兩點之間距離的能力?？捎霉奖硎緸椋?D=/2nsin(/2 ) 式中D：物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。 ：可見光的波長（平均0.55m) n: 物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。 ：鏡口角（即入射角）。,D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰,a,7,油鏡使用的原理 油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進光量，從而使物象更加清晰。,根據(jù)公式D=/2ns

3、in(/2 ) ，增大分母，使得D值減小，分辨率增大。,a,8,1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。 2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度 3.觀察標(biāo)本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。 4.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。 5.油鏡使用結(jié)束后，物鏡用擦鏡紙擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油；第二遍擦鏡紙蘸上二甲苯再擦鏡頭；第三遍再用干凈的擦鏡紙擦去多余的二甲苯。 6.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼用擦鏡紙擦干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。,顯微鏡保養(yǎng)和使用中

4、的注意事項,a,9,三.顯微鏡油鏡觀察操作方法 在高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域滴加香柏油，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標(biāo)本相接。然后用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)，在目鏡下找到最合適的觀察點。,a,10,油鏡使用畢后：上升鏡筒，取下載玻片，用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。,a,11,本實驗室按學(xué)號使用固定編號的顯微鏡，顯微鏡的保養(yǎng)由對應(yīng)學(xué)號的同學(xué)負(fù)責(zé)。實驗過程中如果所用顯微鏡不能使用，自行與其他同學(xué)調(diào)節(jié)。但顯微鏡如果出現(xiàn)問題，由對應(yīng)學(xué)號的同學(xué)承

5、擔(dān)責(zé)任。,a,12,一、實驗?zāi)康?進一步熟悉使用油鏡觀察微生物的方法，初步認(rèn)識細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)特征,（二）細(xì)菌形態(tài)的觀察,a,13,二、觀察內(nèi)容 基本形態(tài)：桿菌，球菌（注意大小、染色性、排列） 特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛，芽胞，莢膜（先找到菌體，再仔細(xì)觀察特殊結(jié)構(gòu)）,以畫圖的方式完成該實驗的報告,a,14,桿菌（大腸桿菌，G-）,畫圖注意事項：1、以圓圈表示視野 2、注意菌體大小比例合適 3、標(biāo)出菌體顏色，顯示典型排列方式 4、特殊結(jié)構(gòu)標(biāo)出菌體和特殊結(jié)構(gòu)所在位置,a,15,（三）革蘭氏染色,一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)微生物涂片、革蘭氏染色的基本技術(shù),a,16,二、 革蘭氏染色的工作原理,革蘭氏染色法是細(xì)菌

6、學(xué)中重要的鑒別染色法。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。,a,17,根據(jù)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌之間細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)差異來達到染色的目的的。 先用結(jié)晶紫初染，所有的細(xì)菌都被染成初染料的藍紫色； 然后用碘媒染，它與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫碘復(fù)合物，從而增強了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。 然后再用乙醇脫色處理,a,18,a,19,由于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、壁厚、類脂質(zhì)含量低，脫色時網(wǎng)孔收縮，結(jié)晶紫碘不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，復(fù)染時仍保持藍紫色。 而革蘭氏陰性菌由于細(xì)胞壁的肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫

7、色處理時類脂被乙醇溶解，細(xì)胞壁透性增大，結(jié)晶紫碘復(fù)合物被洗脫，復(fù)染時細(xì)胞被染上復(fù)染劑的顏色（紅色）。,a,20,大腸桿菌,葡萄球菌,a,21,三、革蘭氏染色的操作方法,a,22,（1）涂片：先在載玻片上滴一滴生理鹽水，再在菌平板上取一小環(huán)培養(yǎng)24小時的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌體于生理鹽水中涂片（，分別于斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜），把菌液充分涂開，使其分布均勻。 注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多，涂片要均勻，不可過于濃厚,a,23,載玻片,水滴,菌體,涂片,a,24,染色前必須固定細(xì)菌，其目的是： 一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上。 二是增加其對染料的親和力

8、。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。,a,25, 干燥：把上面涂好的片于室溫下自然干燥。 涂面朝上，在火焰上方過幾次以熱固定菌體（此操作的目的是使得細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上）。固定時通過火焰12次即可。 注意：不可過熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過高會改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。 初染：滴數(shù)滴結(jié)晶紫于菌膜上（以剛好完全覆蓋菌膜為宜）初染1-2分鐘min，水洗。 媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1min，水洗。,a,26, 脫色：用濾紙吸去載玻片上面的殘水，將玻片傾斜，用95酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約2030s，立即用水沖凈酒精。

9、注意：革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是整個操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。,a,27,復(fù)染：用番紅液染12min,水洗。 鏡檢：干燥后（室溫下晾干），置油鏡觀察（先在低倍鏡，然后在油鏡下觀察菌體細(xì)胞的形態(tài)）。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。 注意：以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。 （9）同法在一載玻片上以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合制片，作革蘭氏染色對比。,a,28,(10). 實驗結(jié)果的記錄： 要求在用顯微鏡觀察（左眼觀察）的同時在實驗記錄本上畫下你所觀察到的細(xì)菌的形態(tài)。,a,29,本實驗每人做一張。

10、 實驗報告中要畫圖表示結(jié)果。,a,30,思考題,1.涂片為何要固定？固定加熱時間過長會怎樣 2.分析影響革蘭氏染色結(jié)果的因素。,a,31,一、實驗?zāi)康?熟悉芽胞染色的方法,（四）芽胞染色,a,32,二、芽胞染色的原理,細(xì)菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色(芽胞呈無色透明狀)。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設(shè)計的。所有的芽胞染色法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外，還需要加熱，以促進芽胞著色。當(dāng)染芽胞時，菌體也會著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然后用對比度強的染料對菌體復(fù)染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便于觀察。,a,33,三、芽孢染色法步驟 (1)取37培養(yǎng)24h 36h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定。 (2)于載片上滴入35滴5孔雀綠水溶液。 (3)用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開始計算時間約45min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時