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1、醫(yī)學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué),1,課件類別,細(xì)胞周期及其調(diào)控 Cell Cycle ATM基因是AT唯一致病基因; 對(duì)AT純合子突變細(xì)胞的研究表明,這類突變細(xì)胞缺乏細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控對(duì)輻射損傷的正常反應(yīng),缺乏輻射誘導(dǎo)P53蛋白增加、p21wAFl和Gadd45轉(zhuǎn)錄和翻譯水平增強(qiáng)的動(dòng)態(tài)變化,表明ATM很可能是DNA損傷反應(yīng)途徑中p53的上游分子。,51,課件類別,ATM(ataxia telangiectasia-mutated gene) 最早發(fā)現(xiàn)于毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥患者,人類中大約有1%的人是ATM缺失的雜合子,表現(xiàn)出對(duì)電離輻射敏感和易患癌癥。 ATM編碼蛋白激酶,與損傷DNA結(jié)合,信號(hào)通路有兩
2、條: 激活Chk1(checkpoint kinase), 使cdc25的Ser216磷酸化失去活性,抑制M-CDK的活性,中斷細(xì)胞周期。 激活Chk2,使P53被磷酸化而激活,然后P53作為轉(zhuǎn)錄因子,導(dǎo)致P21的表達(dá),P21抑制G1-S期CDK的活性,中斷細(xì)胞周期。,52,課件類別,53,課件類別,(3) P16INK4a P16INK4a基因位于人類染色體9p21區(qū),編碼由148個(gè)氨基 酸組成的分子量為16kD蛋白質(zhì)。 P16INK4a與周期蛋白 D1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合G1期激酶CDK4CDK6,抑制其對(duì)pRB 的磷酸化作用,使游離的E2F-1與未磷酸化的PRB結(jié) 合,依賴于E2F-1轉(zhuǎn)錄的基因不
3、能轉(zhuǎn)錄,P16INK4a間接抑 制包括DNA合成在內(nèi)的多種生化反應(yīng),使細(xì)胞周期正 常運(yùn)行。,54,課件類別,(4)pRB pRB的去磷酸化在M及s期由蛋白磷酸酶1催化進(jìn)行。 在周期蛋白CDK復(fù)合物與蛋白磷酸酶1的協(xié)同作用下, pRB的磷酸化去磷酸化之間的動(dòng)態(tài)平衡有效控制著G1 限制點(diǎn)的“開(kāi)啟和關(guān)閉”,從而保證細(xì)胞周期的有序運(yùn)行 及細(xì)胞的正常增殖。,55,課件類別,生長(zhǎng)因子與相應(yīng)受體結(jié)合,通過(guò)信號(hào)傳遞促進(jìn)cyclin基因表達(dá);cyclin與相應(yīng)的CDK結(jié)合為激酶復(fù)合物對(duì)pRb進(jìn)行磷酸化; 磷酸化的pRb釋放其結(jié)合并抑制的蛋白,主要是轉(zhuǎn)錄因子E2F以 及具激酶活性的CAB-1蛋白等;游離的E2F進(jìn)
4、入核內(nèi),與多種具 特殊序列的基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合(如c-myc、b-myb、cdc2、二氫 葉酸還原酶、TK及E2F-1基因等),促進(jìn)這些基因的表達(dá);這些 基因的產(chǎn)物促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S調(diào)控點(diǎn).CKI通過(guò)抑制cyclin-CDK 激酶活性,使pRb不能磷酸化,pRb仍與E2F結(jié)合,E2F則不能進(jìn)入 核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用,使細(xì)胞停滯于G1期.,G1/S調(diào)控點(diǎn)以pRb為中心構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的共同模式,56,課件類別,57,課件類別,細(xì)胞周期長(zhǎng)短測(cè)定,脈沖標(biāo)記DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂指數(shù)觀察測(cè)定法 流式細(xì)胞儀測(cè)定法(Flow Cytometry) 縮時(shí)攝像技術(shù),可以得到準(zhǔn)確的細(xì)胞周期時(shí)間及分 裂間期和分裂期的準(zhǔn)
5、確時(shí)間。,58,課件類別,細(xì)胞周期同步化1,人工選擇同步化( 藥物誘導(dǎo)法) 條件依賴性突變株在細(xì)胞周期同步化中的應(yīng)用: 將與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的條件依賴性突變株轉(zhuǎn)移 到限定條件下培養(yǎng),所有細(xì)胞便被同步化在細(xì)胞周期中某一特定時(shí)期。,59,課件類別,人工選擇同步化2有絲分裂選擇法:用于單層貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn):細(xì)胞未經(jīng)任何藥物處理,細(xì)胞同步化效率高。缺點(diǎn):是 分離的細(xì)胞數(shù)量少。密度梯度離心法: 根據(jù)不同時(shí)期細(xì)胞在體積和重量上存在差別進(jìn)行分離。優(yōu)點(diǎn):方法 簡(jiǎn)單省時(shí),效率高,成本低。缺點(diǎn):對(duì)大多數(shù)種類的細(xì)胞并不適用。,60,課件類別,藥物誘導(dǎo)法(DNA合成阻斷法) G1/S-TdR雙阻斷法:將細(xì)胞群阻斷于
6、G1/S交界處。優(yōu)點(diǎn):同步化效率高,適合所有體外培養(yǎng)細(xì)胞體系。缺點(diǎn):是誘導(dǎo)過(guò)程可造成細(xì)胞非均衡生長(zhǎng)。分裂中期阻斷法 通過(guò)抑制微管聚合來(lái)抑制細(xì)胞分裂器的形成,將細(xì)胞阻斷在細(xì)胞分裂中期。優(yōu)點(diǎn):是操作簡(jiǎn)便,效率高。缺點(diǎn):是這些藥物的毒性相對(duì) 較大。,61,課件類別,第三節(jié) DNA受損阻止細(xì)胞 周期的分子學(xué)說(shuō),62,課件類別,一、DNA損傷的后果:,信號(hào)傳導(dǎo)異常,長(zhǎng)期效應(yīng),老化,腫瘤,疾病,DNA 修復(fù)機(jī)制,短期效應(yīng),異常增生和代謝,生理功能紊亂,細(xì)胞死亡,細(xì)胞增殖減少,基因表達(dá)異常,基因組不穩(wěn)定,63,課件類別,哺乳類動(dòng)物的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制機(jī)制,64,課件類別,65,課件類別,66,課件類別,二
7、、細(xì)胞衰老的理論 (一)基因轉(zhuǎn)錄或翻譯差錯(cuò)、代謝廢物積累; (二) ROS引發(fā)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸分子氧化性損傷; (三)端 粒 鐘 學(xué) 說(shuō)(telomere clock theory) (四)衰老基因與抗衰老基因 1.衰老基因 人類:載脂蛋白E4基因、淀粉樣蛋白基因 p16, p53 p21 RB基因 2. 抗衰老基因 WRN bcl-2,67,課件類別,CDK22,cyclinA、B 和 c-fos表達(dá)下降,不能是Rb磷酸化,E2F與Rb結(jié)合,從而不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用,細(xì)胞不能進(jìn)入S期,細(xì)胞進(jìn)入S期,生長(zhǎng)因子,68,課件類別,(二)細(xì)胞衰老的生化變化 DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)能力 端粒長(zhǎng)度 DNA
8、甲基化 DNA / chromosome 損傷 2. mRNA與核糖體結(jié)合能力 蛋白質(zhì)合成能力 3.蛋白質(zhì)分子損傷,功能 酶活性,69,課件類別,第四節(jié) 細(xì)胞周期與疾病,70,課件類別,一、癌與細(xì)胞周期 癌基因(oncogene) : 能促使細(xì)胞無(wú)限增殖、癌變的DNA序列。分若干基因家族(已發(fā)現(xiàn)近百種癌基因) 抑癌基因(suppression-oncogene):存在于正常細(xì)胞中、能抑制細(xì)胞惡性增殖的基因。,71,課件類別,1細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制失控 Cyclins的過(guò)表達(dá)(Overexpression of cyclins) 腫瘤的發(fā)生與cyclin(D、E)過(guò)量表達(dá)有關(guān)。 Cyclin D1(
9、Bcl-1)過(guò)表達(dá)原因(原癌基因) 乳腺癌、胃癌、食道癌存在Cyclin D1基因擴(kuò)增過(guò)度。,基因突變: Cyclin D1 T286突變 Cyclin D1泛素化受阻 Cyclin D1,72,課件類別,染色體倒位(Chromosome inversion) Cyclin D1基因倒位于甲狀旁腺啟動(dòng)子控制,Cyclin D1蛋白合成 染色體易位(Chromosome translocation) 甲狀旁腺腺癌 Bcl-1 t(11:14) (q13:q32)易位 Cyclin D1受Ig重鏈基因增強(qiáng)子影響 Cyclin D1表達(dá),73,課件類別, CDK 表達(dá)異常 主要見(jiàn)于CDK4、CDK6
10、過(guò)表達(dá)。 CDK4+ cyclin D結(jié)合 CDK4/cyclin D CDKs表達(dá) pRb pRb磷酸化 細(xì)胞增殖過(guò)度 E2F G1/S過(guò)渡加速,【Cyclin D過(guò)表達(dá)致腫瘤機(jī)制】 Cyclin D過(guò)表達(dá) + 生長(zhǎng)因子 CDKs瀑布效應(yīng) 細(xì)胞增殖過(guò)度 易發(fā)生細(xì)胞癌變,可能,74,課件類別, CDI表達(dá)不足和突變 腫瘤細(xì)胞中常出現(xiàn)CDI(腫瘤抑制基因)表達(dá)不足或突變。 p16 InK4基因失活原因 突變或缺失、染色體易位、p16 InK4高度甲基化。,Mechanism p16 InK4基因表達(dá) CDK4與cyclin D結(jié)合 細(xì)胞周期處在“易于”被啟動(dòng)狀態(tài) 易發(fā)生細(xì)胞癌變,75,課件類別,
11、76,課件類別,G1/S交界處失察 P53 進(jìn)入S期 DNA損傷 修復(fù)成功 G1/S檢查 停頓G1期 損傷DNA修復(fù) 修復(fù)失敗 細(xì)胞凋亡 下調(diào)bcl-2表達(dá)、激活bax 基因 P53,77,課件類別,表2 人類腫瘤p53基因突變熱點(diǎn)和頻率 腫瘤型 突變頻率(%) 突變熱點(diǎn) 腫瘤型 突變頻率(%) 突變熱點(diǎn) 肺癌 56 157,248,273 前列腺癌 30 不確定 結(jié)腸癌 50 175,245,248,273 肝細(xì)胞癌 45 249 食道癌 45 不確定 膠質(zhì)癌 25 175、248 卵巢癌 44 273 乳腺癌 22 175、248、273 胰腺癌 44 273 子宮內(nèi)膜癌 22 248 皮膚癌 44
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