產(chǎn)木聚糖酶的食用真菌菌株選育及條件優(yōu)化.doc

產(chǎn)木聚糖酶的食用真菌菌株選育及條件優(yōu)化 （伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春153000） 摘要：采用木聚糖類似物誘導(dǎo)法，對64種食用真菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到產(chǎn)木聚糖酶較高的食用菌株黑木耳LK8。利用正交試驗(yàn)法對黑木耳LK8的液體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示：在液體培養(yǎng)基pH=7.5、底物木聚糖濃度為1g/100mL、培養(yǎng)20天的條件下產(chǎn)酶效果最佳，產(chǎn)酶水平為605.6IU/mL，較優(yōu)化前提高近7倍。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果證明培養(yǎng)液pH值是影響誘導(dǎo)效果的主要因素，利用鹽沉和冷凍干燥法制備木聚糖酶粗酶制劑，得率為43%。 關(guān)鍵詞：木聚糖酶；食用真菌；誘導(dǎo)代謝；條件優(yōu)化 ：S567.3：A 木聚糖酶是一類能夠破壞植物纖維組織，降解半纖維素的一組酶的總稱，屬于水解酶、胞外酶類，具有可誘導(dǎo)性。目前已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、動物飼料喂養(yǎng)、食品行業(yè)加工、能源開發(fā)、環(huán)境綜合治理、造紙行業(yè)以及功能性低聚糖制備等領(lǐng)域1-2。木聚糖酶產(chǎn)生菌主要自然菌株，可通過誘變、蛋白質(zhì)工程、基因工程等分子技術(shù)改變產(chǎn)酶基因，從而提高菌體木聚糖酶的分泌量。目前國內(nèi)外的研究主要集中在利用工程化菌株生產(chǎn)木聚糖酶3-6，而利用大型食用真菌液體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶卻鮮有報(bào)道。因此，本研究用7種木聚糖結(jié)構(gòu)類似物配制液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對64株不同種的大型食用真菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以期篩選出產(chǎn)木聚糖酶能力較強(qiáng)的菌株，并確定最佳產(chǎn)木聚糖酶條件。同時(shí)，制備粗酶制劑，為木聚糖酶生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為其理化性質(zhì)研究做準(zhǔn)備。 1試驗(yàn)材料 1.1試驗(yàn)菌種 64種大型食用真菌包括9株木耳(黑木耳LK5、黑木耳LK7、黑木耳LK916、黑木耳LK9、黑木耳LK10、黑木耳LK12、黑木耳LK15、黑木耳LK8、黑木耳豐收)、16株香菇(香菇L26、香菇L109、香菇9608、香菇2205、香菇2206、香菇939、福建396、香菇1363、香菇856、香菇236、香菇396、香菇208、香菇908、香菇美236、香菇美238、平菇洛加)、11株靈芝(靈芝s1、靈芝s2、靈芝s3、靈芝s4、靈芝s5、靈芝s6、靈芝s7、靈芝s8、靈芝s9、韓靈芝、紅靈芝)及28株其他品種大型真菌(硫磺菌、金耳、白靈菇、灰離、長根菇、杏鮑菇、血耳、大宗菇、豬苓、羊肚菇、柴臉菇、榆黃蘑、大球蓋菇、褶傘密環(huán)菌、灰樹花、塊根蘑、元蘑、白靈菇、玉田平菇、猴頭、茶樹菇、滑子菇、真姬菇、向陽2號、白金鎮(zhèn)、黃金針、華白平菇、茯苓)。 1.2供試培養(yǎng)基及主要化學(xué)試劑 液體培養(yǎng)基(蛋白胨2.0g，酵母膏2.0g，MgSO47H2O0.5g,K2HPO41.0g,KH2PO40.46g)、木聚糖類似物(木聚糖、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、葡萄糖、木糖、微晶纖維素、可溶性淀粉)，3,5二硝基水楊酸(DNS)試劑、檸檬酸磷酸二氫鈉緩沖液(pH5)。 2試驗(yàn)方法 2.1食用真菌液體培養(yǎng) 將培養(yǎng)基與7種木聚糖類似物（添加量為5g/L）分別組合成為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別將64種食用菌接種到培養(yǎng)基內(nèi)，設(shè)置pH值為7.0，25、150r/min的條件下進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)25天，測定培養(yǎng)后的酶活并比較產(chǎn)酶能力。 2.2食用真菌產(chǎn)木聚糖酶的測定 采用透明圈快速檢測法7。篩選具有木聚糖酶的食用真菌菌株，DNS法8測量食用菌培養(yǎng)液的產(chǎn)木聚糖酶活力(1mL酶液在50，pH值5.0條件下，每分鐘水中木聚糖生成1mol木糖還原物質(zhì)的量定為1個(gè)酶活單位，以IU/mL表示)。 2.3木聚糖類似物誘導(dǎo)法培養(yǎng)條件的優(yōu)化 利用正交試驗(yàn)法對黑木耳LK8的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，選用Lg(33)正交表，擬定的正交試驗(yàn)因素與水平(表1)。 2.4粗酶制劑的保存 把經(jīng)過鹽析、濃縮后得到的木聚糖粗酶用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥處理，得到粗酶制劑，為下一步木聚糖酶理化性質(zhì)研究做準(zhǔn)備。 3結(jié)果與分析 3.1產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選 通過透明圈快速檢測法初步檢測出48株食用真菌具有產(chǎn)木聚糖酶的能力，進(jìn)一步通過DNS法檢測出，在不同誘導(dǎo)類似物誘導(dǎo)培養(yǎng)下，產(chǎn)木聚糖酶活力較高的5個(gè)食用真菌菌株分別是：香菇2205、靈芝、杏鮑菇、玉田平菇、黑木耳LK8（表2）。綜合各特征比較，黑木耳LK8透明圈直徑最大，DNS（OD600nm）數(shù)值高于其他菌株，在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出較好的產(chǎn)木聚糖酶能力。因此最終選取伊春林業(yè)科學(xué)院保藏菌種黑木耳LK8進(jìn)行液體培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)。 3.2誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的優(yōu)化 由正交試驗(yàn)結(jié)果分析（表3）可知：誘導(dǎo)培養(yǎng)黑木耳LK8產(chǎn)木聚糖酶最高的條件組合為a1b3c3，即最佳培養(yǎng)時(shí)間、pH值和底物木聚糖濃度（g/100mL）分別為20天、7.5和1g/100mL；優(yōu)化后測定產(chǎn)酶水平為：605.6IU/mL。 由極差數(shù)據(jù)分析(表4）可知：黑木耳LK8受各因素影響的順序是，誘導(dǎo)培養(yǎng)液pH底物濃度誘導(dǎo)時(shí)間，其中pH值是主要因素。 3.3木聚糖酶提取結(jié)果 通過對黑木耳LK8的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，酶活力得到了很大的提高，較之前的Themrascusaurantaicus優(yōu)化菌株9有較高的酶活及產(chǎn)率(表5)，利用鹽沉和冷凍干燥法，每1000mL粗酶液可得到3.581粗酶粉，單位酶活為72050.8IU/g，總酶活為258013.9IU，得率為43%。 4討論與結(jié)論 4.1誘導(dǎo)菌株的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化是誘導(dǎo)食用菌代謝生產(chǎn)木聚糖酶的關(guān)鍵技術(shù)，本試驗(yàn)對64株大型食用真菌采用平板透明圈法和液體發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)相結(jié)合的方法，篩選獲得1株產(chǎn)木聚糖酶較高的菌株，為黑木耳LK8。通過正交試驗(yàn)對菌株黑木耳LK8的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)時(shí)間20天、pH值7.5、底物木聚糖濃度1g/100mL。條件優(yōu)化后菌株LK8產(chǎn)酶水平從原來的86.2IU/mL提高到605.6IU/mL，提高了近7倍；同時(shí)得出影響誘導(dǎo)效果的主要因素是培養(yǎng)液pH值；利用鹽沉和冷凍干燥法制備木聚糖酶粗酶制劑，每1000mL粗酶液得3.581g粗酶粉，單位酶活為72050.8IU/g，總酶活為258013.9IU,得率為43%。利用此誘導(dǎo)培養(yǎng)方法合成的木聚糖酶偏堿性，具有更廣闊的研究潛力和應(yīng)用前景。 4.2研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中食用菌菌絲體對培養(yǎng)基酸堿度要求差別很大，后續(xù)將就食用菌代謝生產(chǎn)的木聚糖的理化性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究，確定其理化性質(zhì)及應(yīng)用范圍，為木聚糖酶的應(yīng)用積累數(shù)據(jù)。 4.3試驗(yàn)過程中菌絲生長前期產(chǎn)多糖比率較高，隨培養(yǎng)時(shí)間延長多糖比率有所下降，產(chǎn)酶能力則是隨菌絲代謝時(shí)間延長而增加，平衡產(chǎn)酶和產(chǎn)多糖時(shí)間點(diǎn)，是后續(xù)的主要研究內(nèi)容。 4.4誘導(dǎo)培養(yǎng)基質(zhì)中的木聚糖類似物可誘導(dǎo)該酶的合成、增加該酶代謝量，此試驗(yàn)正是基于利用食用菌生長代謝特性與木聚糖酶的合成特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。我國食用菌產(chǎn)量大，液體培養(yǎng)技術(shù)成熟，所以，探究大型食用真菌的深層研究價(jià)值，利用其生產(chǎn)木聚糖酶及相關(guān)酶系將成為未來科研的一個(gè)主要方向。 參考文獻(xiàn) 1郭清吉.木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選、酶學(xué)性質(zhì)及宏基因組文庫的構(gòu)建與篩選D.青島科技大學(xué),xx(6). 2王宜磊,鄧振旭.透明圈法快速篩選半纖維素分解菌J.生物技術(shù),2000,10(1):37-39. 3MalabadiRB,RaghvendraS,KumarSV.Productionofcellulose-freexylanasefromanovelyeastusedforbiobleachinginpaperindustry.ResearchJournalofMicrobiology,xx.2(1):24-33. 4GigiC,AdinaC,GabrielaE.Optimizationofbiosynthesis conditionsandcatalyticbehaviorevaluationofcellulose-freexylanaseproducedbyanewStreptomycessp.Strain.AUDJC-FoodTechnology,xx.36(1):34-44. 5于俊杰,赫榮琳,武改紅,等.復(fù)合木質(zhì)纖維素酶菌株篩選及其培養(yǎng)條件優(yōu)化J.生物技術(shù)通報(bào),xx(4):101-109. 6李里特,丁長河,江正強(qiáng),等.一株產(chǎn)木聚糖酶鏈霉菌的鑒定及發(fā)酵產(chǎn)酶J.微生物學(xué)通報(bào),xx,30(6):59-64. 7王宜磊,鄧振旭.透明圈法快速篩選半纖維素分解菌J.生物技術(shù),2000,10(1):37-39. 8沈誠,李戎,胡婷莉,等.木聚糖酶活力的二硝基水楊酸（DNS）測定法J.印染,xx(2):35-39. 9韓曉芳,鄭連爽.產(chǎn)木聚糖酶嗜堿細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究J.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,xx,3(11):25-2