酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性課件

1、酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性1 A 蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) A 酶譜法檢測(cè)血清中基質(zhì)金屬蛋白酶酶譜法檢測(cè)血清中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2 和和MMP-9活性活性 A 食管癌患者血液中食管癌患者血液中MMP-2和和MMP-9的活的活 性變化及其臨床意義性變化及其臨床意義 綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)-2-2 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性2 此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個(gè)部分此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個(gè)部分 第一部分，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)第一部分，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 第二部分，酶譜法檢測(cè)血清中基質(zhì)金屬蛋白酶第二部分，酶譜法檢測(cè)血清中基質(zhì)金屬蛋白酶

2、MMP-2 和和MMP-9的活性的活性 1.第三部分，食管癌患者血液中第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和和MMP-9的活性的活性 變化及其臨床意義變化及其臨床意義 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性3 第一部分，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)第一部分，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象，也稱空間結(jié)構(gòu)或高級(jí)結(jié)構(gòu)，是指蛋白質(zhì)分子中原子和基團(tuán)在蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象，也稱空間結(jié)構(gòu)或高級(jí)結(jié)構(gòu)，是指蛋白質(zhì)分子中原子和基團(tuán)在 三維空間上的排列、分布及肽鏈的走向。高級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物功能或活三維空間上的排列、分布及肽鏈的走向。高級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物功能或活 性所必須的。性所必須的。 X射

3、線晶體學(xué)方法是至今為止研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最有效的方法，所能達(dá)到的精度是射線晶體學(xué)方法是至今為止研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最有效的方法，所能達(dá)到的精度是 任何其他方法所不能比擬的，它的缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)的晶體難以培養(yǎng)，晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定任何其他方法所不能比擬的，它的缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)的晶體難以培養(yǎng)，晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定 的周期較長(zhǎng)。的周期較長(zhǎng)。 近年發(fā)展起來的多維核磁共振方法可以直接測(cè)定蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象，但是由近年發(fā)展起來的多維核磁共振方法可以直接測(cè)定蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象，但是由 于對(duì)樣品的需要量大、純度要求高，被測(cè)定的蛋白質(zhì)的分子量一般不超過于對(duì)樣品的需要量大、純度要求高，被測(cè)定的蛋白質(zhì)的分子量一般不超過20000 Da等原因，也

4、受到很大限制。等原因，也受到很大限制。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性4 截至截至2008年年6月，與迅速增長(zhǎng)的龐大基因組核酸數(shù)據(jù)相反，已知三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白數(shù)量還月，與迅速增長(zhǎng)的龐大基因組核酸數(shù)據(jù)相反，已知三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白數(shù)量還 不到不到6萬個(gè)。（來自蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)萬個(gè)。（來自蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)PDB的統(tǒng)計(jì)）的統(tǒng)計(jì)） 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性5 利用蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)所提供的氨基酸序列信息來進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法就是利用蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)所提供的氨基酸序列信息來進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法就是 應(yīng)這種需要而發(fā)展起來的。應(yīng)這種需要而發(fā)展起來的。 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高

5、級(jí)結(jié)構(gòu)這一論點(diǎn)，仍然是進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的理蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)這一論點(diǎn)，仍然是進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的理 論基礎(chǔ)。論基礎(chǔ)。 目前蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法有：目前蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法有： （1）在已知結(jié)構(gòu)（如晶體結(jié)構(gòu)）的基礎(chǔ)上利用分子動(dòng)力學(xué)方法研究蛋白質(zhì)分子、）在已知結(jié)構(gòu)（如晶體結(jié)構(gòu)）的基礎(chǔ)上利用分子動(dòng)力學(xué)方法研究蛋白質(zhì)分子、 核酸分子或復(fù)合物的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。核酸分子或復(fù)合物的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。 （2）利用能量?jī)?yōu)化或分子動(dòng)力學(xué)方法對(duì)結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行優(yōu)化；或者是在整體結(jié)構(gòu)已）利用能量?jī)?yōu)化或分子動(dòng)力學(xué)方法對(duì)結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行優(yōu)化；或者是在整體結(jié)構(gòu)已 知的情況下建立點(diǎn)突變體的結(jié)構(gòu)。知的情況下建立點(diǎn)突變體的

6、結(jié)構(gòu)。 （3）借助于類似物的結(jié)構(gòu)參數(shù)建立未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。）借助于類似物的結(jié)構(gòu)參數(shù)建立未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。 （4）結(jié)合）結(jié)合2D-NMR數(shù)據(jù)或數(shù)據(jù)或X-RAY粗結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)或其他的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立蛋白質(zhì)的整體粗結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)或其他的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立蛋白質(zhì)的整體 模型結(jié)構(gòu)模型。模型結(jié)構(gòu)模型。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性6 （5）在上述條件均不符合的情況下，根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確度）在上述條件均不符合的情況下，根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確度65。 （6）在已知二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行片段堆積，根據(jù)從已知結(jié)構(gòu)得出的一些規(guī)則進(jìn)行篩選，）在已知二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行片段堆積，根據(jù)從已知

7、結(jié)構(gòu)得出的一些規(guī)則進(jìn)行篩選， 挑選可能的結(jié)構(gòu)，往往得到多種可能性，尚不能得到唯一的正確堆積方式。挑選可能的結(jié)構(gòu)，往往得到多種可能性，尚不能得到唯一的正確堆積方式。 （7）在單體結(jié)構(gòu)已知的情況下，建立復(fù)合物或多聚體的結(jié)構(gòu)，參考復(fù)合物或聚合物本）在單體結(jié)構(gòu)已知的情況下，建立復(fù)合物或多聚體的結(jié)構(gòu)，參考復(fù)合物或聚合物本 身身 的性質(zhì)，利用幾何匹配和最大接觸面積規(guī)則進(jìn)行。的性質(zhì)，利用幾何匹配和最大接觸面積規(guī)則進(jìn)行。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性7 從待測(cè)蛋白質(zhì)序列出發(fā)，搜索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（如從待測(cè)蛋白質(zhì)序列出發(fā)，搜索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（如PDB,SWISS-PROT等），等），

8、得到許多相似序列（同源序列），選定其中一個(gè)（或幾個(gè)）作為待測(cè)蛋白質(zhì)序列得到許多相似序列（同源序列），選定其中一個(gè)（或幾個(gè)）作為待測(cè)蛋白質(zhì)序列 的模板；的模板； 待測(cè)蛋白質(zhì)序列與選定的模板進(jìn)行再次比對(duì)，插入各種可能的空位使兩者的保守待測(cè)蛋白質(zhì)序列與選定的模板進(jìn)行再次比對(duì)，插入各種可能的空位使兩者的保守 位置盡量對(duì)齊；位置盡量對(duì)齊； 建模：調(diào)整待測(cè)蛋白序列中主鏈各個(gè)原子的位置，產(chǎn)生與模板相同或相似的空間建模：調(diào)整待測(cè)蛋白序列中主鏈各個(gè)原子的位置，產(chǎn)生與模板相同或相似的空間 結(jié)構(gòu)，待測(cè)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型；結(jié)構(gòu)，待測(cè)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型； 利用能量最小化原理，使待測(cè)蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)處于能量最小的位置。利用

9、能量最小化原理，使待測(cè)蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)處于能量最小的位置。 同源建模法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)一般由四步完成：同源建模法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)一般由四步完成： 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性8 SWISS-MODEL 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) SWISS-MODEL利用同源建模的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)一段未知序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。該服務(wù)創(chuàng)利用同源建模的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)一段未知序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。該服務(wù)創(chuàng) 建于建于1993年，開創(chuàng)了自動(dòng)建模的先河，并且它是訖今為止應(yīng)用最廣泛的免費(fèi)服務(wù)之一。年，開創(chuàng)了自動(dòng)建模的先河，并且它是訖今為止應(yīng)用最廣泛的免費(fèi)服務(wù)之一。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MM

10、P-9的活性9 First Approach mode(簡(jiǎn)捷模式）簡(jiǎn)捷模式） 這種模式提供一個(gè)簡(jiǎn)捷的用戶介面：用戶只需要輸入一條氨基酸序列，服務(wù)器就會(huì)自動(dòng)這種模式提供一個(gè)簡(jiǎn)捷的用戶介面：用戶只需要輸入一條氨基酸序列，服務(wù)器就會(huì)自動(dòng) 選擇合適的模板。如果一條模板與提交的目標(biāo)序列相似度大于選擇合適的模板。如果一條模板與提交的目標(biāo)序列相似度大于25%25%，建模程序就會(huì)自動(dòng)開，建模程序就會(huì)自動(dòng)開 始運(yùn)行，結(jié)果以始運(yùn)行，結(jié)果以Email形式返回。形式返回。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性10 常用觀看蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的軟件常用觀看蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的軟件 RasMol WPDB Cn3D

11、酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性11 第二部分，酶譜法檢測(cè)血清中基質(zhì)金屬蛋白酶第二部分，酶譜法檢測(cè)血清中基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP-2和和MMP-9的活性的活性 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性12 常見電泳技術(shù)常見電泳技術(shù) 按支持介質(zhì)的不同可分為：按支持介質(zhì)的不同可分為： 紙電泳（紙電泳（Paper electrophorisis） 醋酸纖維薄膜電泳（醋酸纖維薄膜電泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 瓊脂凝膠電泳（瓊脂凝膠電泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（

12、Polyacrylamide Gel-electrophoresis） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE,十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）聚丙烯酰胺凝膠電泳法） 按支持介質(zhì)形狀不同可它為：按支持介質(zhì)形狀不同可它為： 薄層電泳薄層電泳 板電泳板電泳 柱電泳柱電泳 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性13 電泳設(shè)備電泳設(shè)備 垂直電泳系統(tǒng)垂直電泳系統(tǒng) 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性14 水平電泳系統(tǒng)水平電泳系統(tǒng) 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性15 聚丙烯酰胺凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠電泳原

13、理 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺 (N,N -methylene-bisacylamide,簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑在加速劑 N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N,N,N,N- tetram-ethyl ethylenedia mine，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱TEMED)和催化劑過硫酸銨和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱AP) 的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠

14、，以此凝膠為支持物的 電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱PAGE)。 N,N-甲叉（亞甲基）甲叉（亞甲基） 雙丙烯酰胺雙丙烯酰胺 催化劑催化劑 丙烯酰胺丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性16 聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：聚丙烯酰胺凝膠有下列特性： 在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好； 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；

15、對(duì)對(duì)pHpH和溫度變化較穩(wěn)定；和溫度變化較穩(wěn)定； 幾乎無吸附和電滲作用，只要幾乎無吸附和電滲作用，只要AcrAcr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好； 樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)1010-6 -6g g； ； 凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃 度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑； 1.1.分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸分辨率高，尤其在不連

16、續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸 纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性17 SDSPAGE的原理的原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀 態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。 而而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個(gè)技術(shù)首先是僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個(gè)技術(shù)

17、首先是1967年由年由 shapiro建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后， 蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。 SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷）是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷 裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而

18、強(qiáng)還 原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中 加入還原劑和加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白結(jié)合成蛋白 - SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的蛋白量，這樣就消除了不同分子間膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的蛋白量，這樣就消除了不同分子間 的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。 因此在電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)分子大小。因此在電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于

19、蛋白質(zhì)分子大小。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性18 不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中運(yùn)動(dòng)示意圖不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中運(yùn)動(dòng)示意圖 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性19 不同聚丙烯酰胺凝膠濃度對(duì)不同分子量的不同聚丙烯酰胺凝膠濃度對(duì)不同分子量的 蛋白質(zhì)混合物分離能力的關(guān)系蛋白質(zhì)混合物分離能力的關(guān)系 5 51010 1515 2929 4545 6666 9797 200200 2929 4545 6666 9797 200200 2929 4545 6666 9797 200200 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性20 腫瘤細(xì)胞的侵襲移動(dòng)

20、腫瘤細(xì)胞的侵襲移動(dòng) C B A D 腫瘤細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞粘附并穿越細(xì)胞外基質(zhì)，包括三個(gè)重要的步驟：腫瘤細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞粘附并穿越細(xì)胞外基質(zhì)，包括三個(gè)重要的步驟： 粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，細(xì)胞經(jīng)缺口移動(dòng)。粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，細(xì)胞經(jīng)缺口移動(dòng)。 腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織和血管的侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織和血管的侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。 轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在原灶外存活和增殖，這是癌癥對(duì)人類生命的最大威脅。轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在原灶外存活和增殖，這是癌癥對(duì)人類生命的最大威脅。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性21 細(xì)胞間基質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖細(xì)胞間

21、基質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖 細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)主要成份由膠原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基主要成份由膠原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基 葡聚糖組成。葡聚糖組成。 ECM在上皮或內(nèi)皮細(xì)胞的基底部，即以基底膜在上皮或內(nèi)皮細(xì)胞的基底部，即以基底膜(basement membranes，BM)的形式存的形式存 在，在細(xì)胞間結(jié)構(gòu)以間質(zhì)結(jié)締組織在，在細(xì)胞間結(jié)構(gòu)以間質(zhì)結(jié)締組織(interstitial connective tissue)形式存在。形式存在。 膠原是膠原是ECM的主要成分，目前已發(fā)現(xiàn)，至少有的主要成分，目前已發(fā)現(xiàn)，至少有12種不同膠原類型，其中以種不同膠原類型，

22、其中以I、 型膠原是間質(zhì)結(jié)締組織中的主要成分。型膠原是間質(zhì)結(jié)締組織中的主要成分。型膠原則主要存在于基底膜內(nèi)。型膠原則主要存在于基底膜內(nèi)。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性22 腫瘤細(xì)胞的侵襲是需要與細(xì)胞增殖、分化、移動(dòng)的相關(guān)基因及其表達(dá)調(diào)控模式的改變腫瘤細(xì)胞的侵襲是需要與細(xì)胞增殖、分化、移動(dòng)的相關(guān)基因及其表達(dá)調(diào)控模式的改變 和促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)的外界因素兩者的共同作用。和促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)的外界因素兩者的共同作用。 雖然腫瘤細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制還不是十分清楚，但已發(fā)現(xiàn)許多調(diào)控細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)雖然腫瘤細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制還不是十分清楚，但已發(fā)現(xiàn)許多調(diào)控細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān) 鍵分子及其信號(hào)通路。鍵

23、分子及其信號(hào)通路。 腫瘤細(xì)胞通過其表面受體與腫瘤細(xì)胞通過其表面受體與ECM中的各種成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶類來降中的各種成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶類來降 解基質(zhì)，從而形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移運(yùn)行通道。一般惡性程度高的腫解基質(zhì)，從而形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移運(yùn)行通道。一般惡性程度高的腫 瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的蛋白水解作用，可侵蝕破壞包膜，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。目前較為關(guān)注的酶主瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的蛋白水解作用，可侵蝕破壞包膜，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。目前較為關(guān)注的酶主 要是絲氨酸蛋白酶類，如纖溶酶原激活物要是絲氨酸蛋白酶類，如纖溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)和金屬蛋白

24、酶和金屬蛋白酶 (metalproteinase, MMP)類，如膠原酶類，如膠原酶IV、基質(zhì)降解酶、透明質(zhì)酸酶。、基質(zhì)降解酶、透明質(zhì)酸酶。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性23 MMPs家族成員根據(jù)其在細(xì)胞中表達(dá)部位的不同，分為胞質(zhì)型和膜型兩大類。前者分家族成員根據(jù)其在細(xì)胞中表達(dá)部位的不同，分為胞質(zhì)型和膜型兩大類。前者分 布在胞質(zhì)中，后者表達(dá)在膜上。胞質(zhì)型布在胞質(zhì)中，后者表達(dá)在膜上。胞質(zhì)型MMPs根據(jù)其作用底物的特異性、敏感性及氨根據(jù)其作用底物的特異性、敏感性及氨 基酸序列的同源性分為三大類：基酸序列的同源性分為三大類： （1）間質(zhì)膠原酶，包括）間質(zhì)膠原酶，包括MMP-1

25、、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要為間，其作用底物主要為間 質(zhì)膠原質(zhì)膠原, 即即、和和、型膠原型膠原, 但不能降解明膠和但不能降解明膠和型膠原；型膠原； （2）明膠酶，包括）明膠酶，包括MMP-2和和MMP-9,其作用底物主要是其作用底物主要是型膠原和明膠，還可降解型膠原和明膠，還可降解、 、型膠原型膠原,但不能降解間質(zhì)膠原；但不能降解間質(zhì)膠原； （3）間充質(zhì)溶解素，包括）間充質(zhì)溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和和MMP-11，其作用底物主要是，其作用底物主要是 基質(zhì)中的蛋白多糖和糖蛋白，如纖維粘連蛋白基質(zhì)中的蛋白多糖和糖蛋白，如纖維粘連蛋白(FN)、層粘連

26、蛋白、層粘連蛋白(LN)，間充質(zhì)溶解素，間充質(zhì)溶解素 對(duì)膠原的作用不同于間質(zhì)膠原酶和明膠酶，它們能降解對(duì)膠原的作用不同于間質(zhì)膠原酶和明膠酶，它們能降解、型膠原酶以及型膠原酶以及 型膠原的氨基端。型膠原的氨基端。 通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑 等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。 基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白家族 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性24 MMP-2又叫明膠酶又叫

27、明膠酶A， 其蛋白主要由纖維結(jié)締組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，分子量其蛋白主要由纖維結(jié)締組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，分子量 為為72kDa。 MMP-9又稱為明膠酶又稱為明膠酶B，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞多形核白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞多形核白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。 分子量為分子量為92kDa，是，是MMPs中分子量最大的酶。中分子量最大的酶。 中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin， NGAL)是是1993年年Kjeldsen等人在研究等人在研究MMP-9在細(xì)胞內(nèi)存在形式時(shí)發(fā)現(xiàn)

28、的，它能夠在細(xì)胞內(nèi)存在形式時(shí)發(fā)現(xiàn)的，它能夠 與與MMP-9聚合形成異源二聚體，保護(hù)和調(diào)節(jié)聚合形成異源二聚體，保護(hù)和調(diào)節(jié)MMP-9活性，從而促進(jìn)惡變細(xì)胞的浸活性，從而促進(jìn)惡變細(xì)胞的浸 潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。 檢測(cè)檢測(cè)MMP-9和和MMP-2的活性，對(duì)分析腫瘤細(xì)胞惡性程度和預(yù)后提供幫助。的活性，對(duì)分析腫瘤細(xì)胞惡性程度和預(yù)后提供幫助。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性25 由由N 端的端的310螺旋、螺旋、C 端的端的螺旋和中間的和中間的八段反平行的螺旋和中間的和中間的八段反平行的折疊所構(gòu)成，這折疊所構(gòu)成，這 八段反平行式八段反平行式折疊構(gòu)成了一個(gè)折疊構(gòu)成了一個(gè)折疊桶結(jié)構(gòu)。折疊桶結(jié)

29、構(gòu)。 此此折疊桶結(jié)構(gòu)一端是開放的，為與配體結(jié)合提供了進(jìn)口；而另一端則被短的折疊桶結(jié)構(gòu)一端是開放的，為與配體結(jié)合提供了進(jìn)口；而另一端則被短的N 端端 310螺旋所封閉。在螺旋所封閉。在折疊桶底部?jī)?nèi)側(cè)排列著疏水的芳香族和脂肪族氨基酸殘基，折疊桶底部?jī)?nèi)側(cè)排列著疏水的芳香族和脂肪族氨基酸殘基， 形成了一個(gè)疏水核或疏水內(nèi)部，為結(jié)合親脂性配體提供了位點(diǎn)。形成了一個(gè)疏水核或疏水內(nèi)部，為結(jié)合親脂性配體提供了位點(diǎn)。 NGAL的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性26 MMP-2的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) Pre: 信號(hào)肽序列信號(hào)肽序列 Pro: 帶巰基的前肽帶巰基的前肽 Zn: Zn離子結(jié)

30、合部分離子結(jié)合部分 II: 能結(jié)合膠原的能結(jié)合膠原的II型纖維結(jié)合素結(jié)構(gòu)域型纖維結(jié)合素結(jié)構(gòu)域 H: 絞鏈區(qū)絞鏈區(qū) Hemopexin：類血紅素蛋白結(jié)構(gòu)，由四段重復(fù)序列組成，其中：類血紅素蛋白結(jié)構(gòu)，由四段重復(fù)序列組成，其中 第一個(gè)與第四個(gè)間存在一第一個(gè)與第四個(gè)間存在一 個(gè)二硫鍵。個(gè)二硫鍵。 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性27 MMP-9的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 由三個(gè)由三個(gè)螺旋與螺旋與5個(gè)個(gè)折疊構(gòu)成折疊構(gòu)成 含有含有2個(gè)鋅離子和個(gè)鋅離子和5個(gè)鈣離子個(gè)鈣離子 右圖可見一個(gè)小分子化合物位于酶活性中心，并與一個(gè)鋅離子結(jié)合右圖可見一個(gè)小分子化合物位于酶活性中心，并與一個(gè)鋅離子結(jié)合 酶譜法檢測(cè)血

31、清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性28 NGAL能與能與MMP-9以二硫鍵的方式結(jié)合，能起到保護(hù)和調(diào)節(jié)以二硫鍵的方式結(jié)合，能起到保護(hù)和調(diào)節(jié)MMP-9功能的作用，所以功能的作用，所以NGAL 與腫瘤的侵襲移動(dòng)有密切的聯(lián)系。與腫瘤的侵襲移動(dòng)有密切的聯(lián)系。 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組以轉(zhuǎn)染有汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組以轉(zhuǎn)染有pcDNA3 空白質(zhì)?？瞻踪|(zhì)粒 載體的載體的SHEEC 細(xì)胞為對(duì)照，酶譜法檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染有細(xì)胞為對(duì)照，酶譜法檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染有pcDNA-NGAL (-) 的的SHEEC 細(xì)胞細(xì)胞 分泌的分泌的MMP-9 和

32、和MMP-2的活性均明顯降低；而與此同時(shí)，轉(zhuǎn)染有的活性均明顯降低；而與此同時(shí)，轉(zhuǎn)染有pcDNA-NGAL () 的的 SHEEC 細(xì)胞分泌的細(xì)胞分泌的MMP-9 和和MMP-2的活性均明顯升高。表明通過有義、反義技術(shù)使的活性均明顯升高。表明通過有義、反義技術(shù)使NGAL 基因表達(dá)發(fā)生改變可以對(duì)基因表達(dá)發(fā)生改變可以對(duì)SHEEC 細(xì)胞分泌的細(xì)胞分泌的MMP-9 和和MMP-2 的活性產(chǎn)生明顯影響。的活性產(chǎn)生明顯影響。 M：蛋白：蛋白marker；1. 細(xì)胞培養(yǎng)基；細(xì)胞培養(yǎng)基；2. pcDNA3；3. pcDNA-NGAL ( + )；4. pcDNA-NGAL ( - ) 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白

33、酶MMP-MMP-9的活性29 MMP-2和和MMP-9活性的強(qiáng)弱與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力密切相關(guān)。明膠是這兩種酶的活性的強(qiáng)弱與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力密切相關(guān)。明膠是這兩種酶的 底物。所以在體外通過酶譜法（底物。所以在體外通過酶譜法（Zymography）檢測(cè)樣品（組織，細(xì)胞培養(yǎng)液，血清，）檢測(cè)樣品（組織，細(xì)胞培養(yǎng)液，血清， 血漿，尿）中血漿，尿）中MMP-2和和MMP-9的活性，對(duì)了解腫瘤細(xì)胞的惡性程度、監(jiān)測(cè)治療效果的活性，對(duì)了解腫瘤細(xì)胞的惡性程度、監(jiān)測(cè)治療效果 和評(píng)價(jià)預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。和評(píng)價(jià)預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。 酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙

34、烯酰胺（聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含，含0.1明膠）電明膠）電 泳分離，然后在有二價(jià)金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的泳分離，然后在有二價(jià)金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和和MMP-9恢復(fù)恢復(fù) 活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色， 在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和和MMP-9活性成正比?；钚猿烧取?實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性30 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 樣品制備樣品

35、制備: : 血清、血漿和尿樣品可取適量直接與血清、血漿和尿樣品可取適量直接與2SDS 樣品緩沖液等體積混勻進(jìn)行下樣品緩沖液等體積混勻進(jìn)行下 一步實(shí)驗(yàn)，如酶活性太高造成顯帶不理想，可適當(dāng)進(jìn)行稀釋一步實(shí)驗(yàn)，如酶活性太高造成顯帶不理想，可適當(dāng)進(jìn)行稀釋; 凝膠的制備凝膠的制備: : 玻璃板對(duì)齊后放入夾中垂直卡緊。按表格配玻璃板對(duì)齊后放入夾中垂直卡緊。按表格配10分離膠，加入分離膠，加入TEMED后后 立即搖勻即可灌膠，灌膠時(shí)，可用立即搖勻即可灌膠，灌膠時(shí)，可用5ml加樣槍吸取凝膠沿玻璃板加進(jìn)去，然后膠上加一加樣槍吸取凝膠沿玻璃板加進(jìn)去，然后膠上加一 層異丙醇，以隔離空氣中的氧，促進(jìn)凝膠聚合（灌膠時(shí)開始

36、可快一些，膠面快到所需層異丙醇，以隔離空氣中的氧，促進(jìn)凝膠聚合（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需 高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)凝膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡）。約高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)凝膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡）。約 幾分鐘后當(dāng)異丙醇和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了，再等幾分鐘后當(dāng)異丙醇和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了，再等3min使膠充分凝固使膠充分凝固 就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面表格配就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面表格配4的濃縮膠，加入的濃縮膠，加入TEMED后后 立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要 使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。待到濃縮膠凝使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。待到濃縮膠凝 固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出; 酶譜法檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MMP-9的活性31 在每個(gè)加樣孔中加入在每個(gè)加樣孔中加入10 l樣品樣品; 電泳：電泳： 在在4 100V下，約下，約2h; 凝膠的處理：凝膠的處理： （1）電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中