微生物限檢查法操作規(guī)程

1、定義 微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔 料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉 菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。 本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為 3035；霉菌、 酵母菌培養(yǎng)溫度為 2328。 檢驗(yàn)結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2為單位報(bào)告， 特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告。 檢查環(huán)境 微生物限度檢查環(huán)境在潔凈度C級(jí)下的局部潔 凈度B級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。 微生物限度檢查室 要求 溫度：1826； 相對(duì)濕度：4565 ； 壓差：潔凈室與外 界壓差30Pa 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng) 基、 曙紅

2、亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、四 硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基、膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基 稀釋液和沖洗液 0.1%蛋白胨水溶液 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 0.9%氯化鈉溶液 供試品的保存 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿 冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件 不妥引起致死或繁殖。 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁 開(kāi)啟。包裝已開(kāi)啟的樣品不得作為供試品。 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 以頭孢氨芐膠囊為例 1.在潔凈室使用記錄上登記好頭孢氨芐膠囊的規(guī)格、 批號(hào)；準(zhǔn)備一張微生物限度檢查空白記錄，填好除檢驗(yàn)結(jié) 果以及溫濕度外的其他必要信息。 2.準(zhǔn)備好相應(yīng)的檢查用品： 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基

3、各1瓶融化后，放入烤箱中待 用 100mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 1瓶 9ml/管的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液4支 0.1%蛋白胨水溶液（500ml瓶） 濾杯 沉降菌平皿 空白平皿 -吸管、鑷子、剪刀等放入不銹鋼盒中經(jīng)干熱滅菌后待用 3.配置消毒液 0.1%潔爾滅溶液 75%乙醇 傳遞窗 物料 微生物限度 檢查室 注注：進(jìn)入無(wú)菌檢驗(yàn) 室的樣品若有兩層 包裝的，需將外包 裝在傳遞窗或緩沖 間拆除后，經(jīng)傳遞 窗傳入實(shí)驗(yàn)室。 4.將待檢樣品以及的相關(guān)用品（包括培養(yǎng)基、 緩沖液以及檢測(cè)用器皿等），經(jīng)傳遞窗紫外消毒60分鐘后， 再轉(zhuǎn)運(yùn)至微生物限度檢查室。 5.按空調(diào)機(jī)組上的F2”鍵，開(kāi)啟空調(diào)

4、；通 過(guò)物流通道處的按鈕，開(kāi)啟凈化工作臺(tái)。 化驗(yàn)人員按照進(jìn)出微生物檢測(cè)室更衣 操作規(guī)程進(jìn)行正確的更衣。 進(jìn)入更鞋室更鞋脫去工作服及私人衣物（只剩貼身內(nèi) 衣、內(nèi)褲）掛在衣鉤上并將所有頭發(fā)塞入發(fā)網(wǎng)中固定 洗手用手肘開(kāi)門(mén)進(jìn)入一更。 然后取GEL溶液23ml，采用六步法對(duì)雙手和手腕進(jìn)行消 毒（在30秒內(nèi)保持雙手完全被GEL覆蓋）用手肘開(kāi)門(mén)進(jìn) 入C級(jí)二更（黃色地面）。 在二更更鞋，然后戴上綢帽，綢帽應(yīng)包裹住全部頭發(fā)；再 戴上口罩，口罩必須覆蓋嘴、鼻，在腦后勒緊；最后穿潔 凈區(qū)連體工作服，依次將左腳、右腳、左手、右手穿入 （過(guò)程中應(yīng)避免碰觸潔凈衣外表面，同時(shí)潔凈衣也不得接 觸地面或墻面）檢查自己的著裝用手

5、肘開(kāi)門(mén)進(jìn)入C級(jí) 緩沖間。 在C級(jí)緩沖間，用手肘開(kāi)門(mén)分別進(jìn)入C級(jí)微生物限度檢查 室一和檢查室二，帶上無(wú)菌手套，再在消毒液中浸泡約30 秒。 化驗(yàn)人員用浸泡了消毒液的無(wú)菌毛巾，擦拭凈化 工作臺(tái)臺(tái)面。 打開(kāi)傳遞窗，將相關(guān)的檢查用品依次擺放在不銹 鋼桌上和凈化工作臺(tái)上。（鑷子和剪刀應(yīng)插入 75%酒精棉球中） 準(zhǔn)備7個(gè)沉降菌平皿，做 好標(biāo)記和日期 在凈化工作臺(tái)上和檢查室 地面上擺放好沉降菌平皿。 用消毒液清洗浸泡雙手， 將消毒毛巾貼好，放在凈 化工作臺(tái)臺(tái)面上。 凈化工作臺(tái)2個(gè) 檢查室地面2個(gè) 操作者手指1個(gè) 消毒液1個(gè) 空白對(duì)照1個(gè) 供試液的制備原則 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜 的方法制

6、備供試液。所用乳化劑，分散劑、中和 劑或滅活劑及其用量應(yīng)證明是有效的，并對(duì)微生 物無(wú)毒性。供試液的制備若需用水浴加溫時(shí)，溫 度不應(yīng)超過(guò)45，時(shí)間不得超過(guò)30min 常用的供試品制備方法 液體供試品 取供試品10ml，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液 至100ml，混勻，作為1：10的供試液。水溶性液體 制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。 固體、半固體或粘稠液供試品 稱(chēng)取供試品10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液 至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1： 10供試液。有必要時(shí)可適當(dāng)加溫（不應(yīng)超過(guò)45）。 供試液的制備 取10g頭孢氨芐膠囊于磨口瓶中，用無(wú)菌剪刀將其剪碎，

7、 加入100mlpH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液混勻，作為1： 10供試液。靜止得上清液備用。 在供試液靜止沉淀的同時(shí)準(zhǔn)備8個(gè)無(wú)菌平皿，每2皿 為一組，分別在每組的2個(gè)平皿蓋上分別依次注明 “0（空白）,10-1, 10-2, 10-3”。 準(zhǔn)備3瓶膽鹽乳糖培養(yǎng)基，分別在瓶上注明”1-/2, 1+/2, 0/2,其中2標(biāo)示當(dāng)月2號(hào)，1表示當(dāng)天所做的第 一個(gè)樣品、+：表示樣品陽(yáng)性，-：表示樣品、0：表 示陰性對(duì)照。 細(xì)菌和控制菌檢查 薄膜過(guò)濾法 制備平皿 準(zhǔn)備2個(gè)無(wú)菌平皿，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15- 20ml，半蓋蓋，除出去冷凝水后，蓋上平皿蓋待 凝。 火焰噴射器在檢驗(yàn)儀的過(guò)濾頭表面滅菌35秒鐘

8、。 鑷子在火焰上滅菌并冷卻，夾住3張無(wú)菌濾膜放置在3個(gè)過(guò) 濾頭中央。 將已經(jīng)過(guò)滅菌的過(guò)濾杯小心安裝在過(guò)濾頭上。從過(guò)濾杯的 上邊緣按下過(guò)濾杯卡在過(guò)濾頭上。 在安裝濾杯的時(shí)候，手不要接 觸濾杯的內(nèi)部 預(yù)潤(rùn)濾膜 將事先插在75%酒精棉球中的剪刀過(guò)火焰數(shù)次后，撬 去沖洗液瓶子的鋁塑蓋和膠塞，將瓶口和瓶頸部位過(guò) 火焰數(shù)次。 向3個(gè)過(guò)濾杯中，分別加入少量的0.1%無(wú)菌蛋白胨水 溶液，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)閥門(mén)手柄90度，打開(kāi)過(guò)濾頭對(duì)應(yīng)閥 門(mén)。按下檢驗(yàn)儀的啟停開(kāi)關(guān)啟動(dòng)儀器過(guò)濾。 過(guò)濾樣品 分別取10ml上清液（取相當(dāng)于1g供試品），分別加入3 個(gè)濾杯中過(guò)濾或先將10ml上清液加入100ml0.1%無(wú)菌 蛋白胨水中混勻，

9、再過(guò)濾。 沖洗 用800ml0.1%無(wú)菌蛋白胨水分次沖洗過(guò)濾，每次約 100ml，總沖洗量不得超過(guò)1000ml。 每次沖洗時(shí)沖洗液瓶的瓶口和瓶頸部位應(yīng)過(guò)火焰數(shù)次，每次沖洗時(shí)沖洗液瓶的瓶口和瓶頸部位應(yīng)過(guò)火焰數(shù)次， 在過(guò)濾前后，應(yīng)保持濾膜的完整性。在過(guò)濾前后，應(yīng)保持濾膜的完整性。 樣品過(guò)濾完后，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)閥門(mén)手柄90度，關(guān)閉過(guò)濾頭對(duì) 應(yīng)閥門(mén)，然后按啟停開(kāi)關(guān)停止儀器。 鑷子在火焰上滅菌并冷卻取出第一張濾膜，菌面朝上貼于 制備好的培養(yǎng)基平板上。（濾膜貼于平板上時(shí)不得有空隙 或氣泡，否則影響微生物生長(zhǎng)）。 鑷子再次火焰上滅菌并冷卻分別取出第二張和第三張濾膜， 快速接至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，分別做為

10、樣品和樣品 陽(yáng)性。 取10mlpH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液加入100ml膽 鹽乳糖培養(yǎng)基中作為陰性對(duì)照。 再用火焰噴射器在滅菌檢驗(yàn)儀的過(guò)濾頭 鑷子在火焰上滅菌并冷卻，夾住1張無(wú)菌濾膜放置在1個(gè)過(guò) 濾頭中央。 安裝過(guò)濾杯 用少量的0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，過(guò)濾。 取出濾膜，貼于培養(yǎng)基平板上做為陰性對(duì)照。 酵母菌和霉菌的檢查平皿法 樣品的稀釋 10-2 10-1 10-3 每遞增l稀釋級(jí)，必須另?yè)Q一支吸管。 稀釋時(shí)，吸管插入第1級(jí)稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm， 反復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許， 然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，吸管移至第 2級(jí)稀釋管的內(nèi)

11、壁近液面處（勿接觸液面）緩慢地放出全部 供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無(wú)黏附或殘留液體） 在上述進(jìn)行10倍遞增 稀釋的同時(shí)，以該稀 釋級(jí)吸管，吸取該級(jí) 稀釋液各1ml至2個(gè)滅 菌平皿中，（一般為 左手持平皿，將蓋半 開(kāi)，右手持吸管）， 注入平皿時(shí)，將1ml 供試液慢慢全部注入 平皿中，管內(nèi)無(wú)殘留 液體，防止反流到吸 管尖端部。 陰性對(duì)照 待各級(jí)稀釋液注皿完畢后，用1支吸管 吸取試驗(yàn)用稀釋劑（pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖 液）各1ml，分別注入2個(gè)平皿中 右手拿裝有培 養(yǎng)基的錐形瓶， 左手撥出棉塞。 右手拿錐形瓶，使瓶口 迅速通過(guò)火焰。 用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開(kāi) 一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶 中玫瑰

12、紅瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿， 以順時(shí)針或反時(shí)針?lè)较蚩焖傩D(zhuǎn)平皿 半蓋蓋，除出去冷凝水后， 蓋上平皿蓋至操作臺(tái)上待凝 傾注培養(yǎng)基 注：混勻時(shí) 切勿將培養(yǎng) 基濺到皿邊 及皿蓋上 培養(yǎng)培養(yǎng) 將冷凝后的平板用保 鮮膜包裹好，注明檢 查日期。 倒置培養(yǎng)，細(xì)菌平板 于3035培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)3天。霉菌、酵母 菌計(jì)數(shù)平板于23 28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。 逐日觀察菌落生長(zhǎng)情 況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。 完成微生物限度檢查后，將待培養(yǎng)的樣品、廢棄 物等通過(guò)傳遞窗傳出。 檢查人員對(duì)潔凈室進(jìn)行清潔。 操作結(jié)束后 操作前 每周 每天 清潔和消毒 頻率 細(xì)菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋級(jí)。 霉菌、酵母菌數(shù)先取平均菌落數(shù)在301

13、00之間 的稀釋級(jí)。 因?yàn)槌^(guò)300有凝聚作用，易計(jì)數(shù)偏低，且不易點(diǎn)計(jì)，低于30細(xì)菌 分布不是正態(tài)分布，不能代表其正常計(jì)數(shù)，且數(shù)量減少，誤差增大。 菌落報(bào)告原則 菌落計(jì)數(shù) 一般將平皿置菌落計(jì)數(shù)器或從平皿的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)， 以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。勿漏計(jì)細(xì)小的瓊脂層 內(nèi)和平皿邊緣生長(zhǎng)的菌落。注意細(xì)菌菌落與霉菌菌落和酵 母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等 的區(qū)別。必要時(shí)用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或挑取 可疑物涂片鏡檢。如仍難區(qū)別，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間47天， 細(xì)菌菌落常會(huì)生長(zhǎng)增大而加以區(qū)別。 菌落計(jì)數(shù) 若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重疊，肉眼可辨別時(shí)仍以2 個(gè)菌落或2個(gè)以上

14、菌落計(jì)數(shù)；若平板生長(zhǎng)有鏈狀菌落，菌 落間無(wú)明顯界限，一條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)，但若鏈上出現(xiàn) 性狀與鏈狀菌落不同的可辨菌落時(shí)，仍應(yīng)分別計(jì)數(shù)，若生 長(zhǎng)蔓延較大的片狀菌落或花斑樣菌落，一般不宜作為計(jì)數(shù) 用。 菌落報(bào)告原則菌落報(bào)告原則 如只有1個(gè)稀釋級(jí)平均菌落數(shù)在30300（30-100）之間，則 將該稀釋級(jí)的菌落乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。 稀釋稀釋 菌落數(shù)菌落數(shù) 平均值平均值 報(bào)告報(bào)告 10 1 280 260 270 270 102700 10 2 29 28 10 3 3 2 當(dāng)有當(dāng)有2個(gè)或個(gè)或2個(gè)以上稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定個(gè)以上稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定 時(shí)，以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告。時(shí)

15、，以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告。 如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在30以下，則按最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)以下，則按最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù) 乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。 稀釋稀釋 菌落數(shù)菌落數(shù) 平均值平均值 報(bào)告報(bào)告 10 1 10 12 11 11 10 110 10 2 2 3 10 3 1 3 如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均無(wú)菌落生長(zhǎng)或最低稀釋級(jí)平均落數(shù)小如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均無(wú)菌落生長(zhǎng)或最低稀釋級(jí)平均落數(shù)小 于于1小時(shí)，應(yīng)報(bào)告菌數(shù)為小時(shí)，應(yīng)報(bào)告菌數(shù)為1稀釋倍數(shù)個(gè)稀釋倍數(shù)個(gè)/g或或ml。 結(jié)果報(bào)告 菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告。 菌落數(shù)大于100時(shí)，取兩位有效

16、數(shù)字報(bào)告，第 三位按數(shù)值修約規(guī)則處理。 復(fù)試 供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)其中 任一項(xiàng)一次檢驗(yàn)不合格，應(yīng)重新取2倍包裝量供試品， 依法作單項(xiàng)復(fù)試兩份，以三次檢驗(yàn)結(jié)果的平均值報(bào) 告。 異常情況處理異常情況處理 菌落蔓延 1.加TTC（1000ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂加1的TTC(2、3、5氯化三苯四氮唑瓊氯化三苯四氮唑瓊 脂脂 )1ml ) 2.開(kāi)蓋干燥（將已凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板開(kāi)蓋，倒置傾放于凈化 工作臺(tái)上，開(kāi)機(jī)1-2h合蓋，在倒置于培養(yǎng)箱內(nèi)） 異常菌落數(shù)報(bào)告法 細(xì)菌平皿上長(zhǎng)霉菌、霉菌平皿上長(zhǎng)細(xì)菌，哪個(gè)多，以哪個(gè)計(jì) 數(shù)，不能相加計(jì)數(shù)。 注意事項(xiàng) 1供試品檢驗(yàn)全過(guò)程必須符合無(wú)菌技術(shù)要求。使用滅菌用 具時(shí)，不

17、能接觸可能污染的任何器物，滅菌吸管不得用口 吹吸。 2從供試品稀釋至傾注瓊脂培養(yǎng)基操作應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成， 避免由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致菌細(xì)胞繁殖或死亡。 3供試液稀釋及注皿應(yīng)取均勻的供試液，以免造成實(shí)驗(yàn)誤 差。 4在凈化工作臺(tái)上操作時(shí)，應(yīng)避免雙手來(lái)回出入工作臺(tái) 定義 微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔 料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉 菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。 本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為 3035；霉菌、 酵母菌培養(yǎng)溫度為 2328。 檢驗(yàn)結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2為單位報(bào)告， 特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告。 5.按空調(diào)機(jī)組上的F2”鍵，開(kāi)

18、啟空調(diào)；通 過(guò)物流通道處的按鈕，開(kāi)啟凈化工作臺(tái)。 細(xì)菌和控制菌檢查 薄膜過(guò)濾法 制備平皿 準(zhǔn)備2個(gè)無(wú)菌平皿，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15- 20ml，半蓋蓋，除出去冷凝水后，蓋上平皿蓋待 凝。 樣品過(guò)濾完后，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)閥門(mén)手柄90度，關(guān)閉過(guò)濾頭對(duì) 應(yīng)閥門(mén)，然后按啟停開(kāi)關(guān)停止儀器。 鑷子在火焰上滅菌并冷卻取出第一張濾膜，菌面朝上貼于 制備好的培養(yǎng)基平板上。（濾膜貼于平板上時(shí)不得有空隙 或氣泡，否則影響微生物生長(zhǎng)）。 酵母菌和霉菌的檢查平皿法 樣品的稀釋 10-2 10-1 10-3 每遞增l稀釋級(jí)，必須另?yè)Q一支吸管。 稀釋時(shí)，吸管插入第1級(jí)稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm， 反復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許， 然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，吸管移至第 2級(jí)稀釋管的內(nèi)壁近液面處（勿接觸液面）緩慢地放出全部