生化實(shí)驗(yàn)四乙酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白

1、一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.學(xué)習(xí)區(qū)帶電泳的原理 2.掌握乙酸纖維素膜電泳操作技術(shù)二 實(shí)驗(yàn)原理電泳：帶有電荷的顆粒在電場中向與其電性相反的電極移動(dòng)蛋白質(zhì)分子是兩性電解質(zhì)，由于解離基團(tuán)的差異，不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)血清中含有數(shù)種蛋白質(zhì)，在ph8.6的緩沖溶液中電泳，在同一電泳中涌動(dòng)的方向和速度不同，從而使蛋白質(zhì)混合樣品得以分離電泳后，將薄膜取出，經(jīng)染色和漂洗，可得到背景無色的各蛋白質(zhì)電泳圖譜。各蛋白質(zhì)含量可用光密度計(jì)直接測定，或用洗脫法進(jìn)行比色測定三 器材與試劑器材器材 電泳儀、電泳槽、微量注射器或微量吸管、載玻片、濾紙、竹鑷子、培養(yǎng)皿、紗布、可見光分光光度計(jì)、乙酸纖維素薄膜、血清。 巴爾妥巴爾妥-巴

2、爾妥鈉緩沖液巴爾妥鈉緩沖液 染色劑染色劑 （取氨基黑10b 0.5g，加蒸餾水40ml，甲醇50ml和冰乙酸10ml混勻，可重復(fù)使用。） 漂洗液漂洗液 （乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸餾水50ml混勻。） 透明液透明液 （無水乙醇70ml，冰乙酸30ml混勻。） 浸出液浸出液 （0.4mol/l的naoh溶液） 試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟將乙酸纖維素薄膜切成8cm2cm條狀把薄膜浸入ph8.6的巴比妥巴比妥鈉緩沖液完全浸透后，竹鑷子取出薄膜，無光澤面朝上，平鋪在濾紙上用另外一張濾紙輕壓吸緩沖液吸取23l血清涂在載玻片一端截面處距膜一端1.5cm處相接觸樣品呈直線狀涂于薄膜上血清滲入薄膜內(nèi)移去玻片把薄膜浸

3、入ph8.6的巴比妥巴比妥鈉緩沖液完全浸透后，竹鑷子取出薄膜，無光澤面朝上，平鋪在濾紙上用另外一張濾紙輕壓吸緩沖液吸取23l血清涂在載玻片一端截面處距膜一端1.5cm處相接觸樣品呈直線狀涂于薄膜上血清滲入薄膜內(nèi)移去玻片樣品呈直線狀涂于薄膜上血清滲入薄膜內(nèi)移去玻片樣品呈直線狀涂于薄膜上血清滲入薄膜內(nèi)移去玻片乙酸纖維素薄膜點(diǎn)樣圖薄膜點(diǎn)樣面向上點(diǎn)樣端置于陰極端平貼在電泳槽支架上薄膜兩端分別用四層紗布建鹽橋紗布鹽橋浸入兩極電泳緩沖液中蓋上蓋子，使薄膜充分浸潤調(diào)節(jié)電壓電流待樣品泳動(dòng)距點(diǎn)樣處4.55cm時(shí)關(guān)閉電源薄膜浸于染色液中染色510min,用漂洗液漂洗45次每次約5min背景無色時(shí)浸入蒸餾水中漂洗后

4、吹干浸入透明液中約20min取出，平貼于干凈玻璃板干燥得背景透明的電泳圖譜，觀察7、如要對血清各蛋白進(jìn)行定量測定可采用下列方法。（1）洗脫法 取試管5支，標(biāo)號，分別加入0.4mol/l的naoh溶液4.0ml。 將實(shí)驗(yàn)步驟四漂洗干凈的薄膜用濾紙吸干，剪下各種蛋白質(zhì)色帶，分別放入各試管中，振蕩約10min。 待色澤完全浸出后，以0.4mol/l的naoh溶液為對照，與620nm處測得各管的吸光度，分別記為a清、a1、a2、a、a。 各種血清蛋白的相對百分含量為： 個(gè)別蛋白質(zhì)的a620值 所有蛋白質(zhì)a620值總和 （2）光密度法將步驟5中透明處理的薄膜用光密度計(jì)直接測定（數(shù)值參考書p29） 注意事

5、項(xiàng) 1、乙酸纖維素薄膜一定要完全浸透，如有任何斑點(diǎn)、污染或劃痕，均不能使用。浸泡后的乙酸纖維素薄膜取出后用濾紙吸去其表面的緩沖液即可，不可吸得過干。 2、搭在陰陽兩極上的薄膜應(yīng)完全和鹽橋接觸。多個(gè)膜條進(jìn)行電泳時(shí)，相鄰膜之間應(yīng)留有間隙，不能相互接觸。 3、使用血清點(diǎn)樣器直接在薄膜上進(jìn)行血清點(diǎn)樣，同樣可以獲得很好的效果。 4、電泳時(shí)間的長短，應(yīng)以血清各組分最佳分離效果為標(biāo)準(zhǔn)，一般是在以移動(dòng)最快的血清清蛋白距陽極約1cm處停止電泳。電泳儀和電泳槽 使用方法1.用導(dǎo)線將電泳槽的兩個(gè)電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，不要將正負(fù)極接反。 2.電泳儀電源開關(guān)調(diào)至關(guān)的位置，電壓旋鈕轉(zhuǎn)到最小，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。 3.接通電源，緩緩旋轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)鈕直到達(dá)到的所需電壓為止，設(shè)定電泳終止時(shí)間，此時(shí)電泳即開始進(jìn)行。 4.工作完畢后，應(yīng)將各旋鈕、開關(guān)旋至零位或關(guān)閉狀態(tài)，并拔出電泳插頭。 注意事項(xiàng) 1. 禁接觸電極、電泳物及其它可能帶電部分，不能到電泳槽內(nèi)取放東西，如需要應(yīng)先斷電，以免觸電。 2. 不同介質(zhì)支持物的電泳不要同時(shí)在同一電泳儀上進(jìn)行。 3不超