CNE-2細(xì)胞增殖、凋亡檢測(cè)方法

1、CNE-2細(xì)胞增殖、凋亡檢測(cè)方法1. 目的2. 技術(shù)路線(xiàn)3. 試劑、溶液、耗材、儀器、實(shí)驗(yàn)材料4. 操作步驟：1). MTT法檢測(cè)CNE-2細(xì)胞增殖步驟：(貼壁細(xì)胞法)1. Fen細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在25cm2培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)到接近匯合。用含0.05%胰蛋白酶，0.02% EDTA的PBS消化細(xì)胞5分鐘，洗滌后，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成1×105/ml。2. 取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加0.1ml細(xì)胞懸液，在37 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，讓細(xì)胞帖壁。每孔加0.1ml效應(yīng)細(xì)胞懸液，效靶比10：1到50：1，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，讓效

2、應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮殺傷效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中，設(shè)立只有靶細(xì)胞的無(wú)殺傷對(duì)照和只有 效應(yīng)細(xì)胞的陰性對(duì)照，每種處理設(shè)3各復(fù)孔。3. 用含2%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌各孔 3次，洗去不粘附的細(xì)胞。每孔加 0.1ml含2%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液和10l 5mg/ml的MTT染液，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。4. 用PBS洗滌2次，每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的異丙醇，室溫30分鐘，溶解形成的結(jié)晶。在570nm波長(zhǎng)處，用酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)各孔的光吸收值(OD)。殺傷活性(%)=(OD實(shí)驗(yàn)孔-OD陰性對(duì)照) /OD無(wú)殺傷對(duì)照× 100。MTT法應(yīng)注意事項(xiàng)：1.選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情

3、況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT 試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過(guò)滿(mǎn)。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線(xiàn)性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀(guān)察不到差異。2.藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記!否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。3. 時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定OD值，輸入excel表，最后

4、得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫(huà)出變化的曲線(xiàn)，曲線(xiàn)什么時(shí)候變得平坦了(到了平臺(tái)期)那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時(shí)間點(diǎn)(因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯)。4.培養(yǎng)時(shí)間。200ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的45次方的增殖期細(xì)胞來(lái)說(shuō)，很難維持68h，如果營(yíng)養(yǎng)不夠的話(huà)，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。5.MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。做MTT時(shí)，盡量無(wú)菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。6.理論未必都是對(duì)的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。7.實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔

5、都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。8.避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。MTT配制：通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱(chēng)取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液(PBS)或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的過(guò)程中，容器最好用鋁箔紙包住。需要注意的是，MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相

6、對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線(xiàn)性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒(méi)必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感;往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的

7、照明燈關(guān)掉.配制MTT時(shí)用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60水浴助溶。PBS配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4定容1L2). CCK-8法檢測(cè)CNE-2細(xì)胞增殖CCK法的操作步驟（更多內(nèi)容請(qǐng)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）：實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞活性檢測(cè)1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100L/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37,5% CO2）。2、向每孔加入10 L CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。5、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 L

8、 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化?；盍τ?jì)算：細(xì)胞活力*（）=A(加藥)-A（空白）/A（0加藥）-A（空白） ×100A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度檢測(cè)步驟1. 向各孔中加入100 l細(xì)胞懸液。a)2. 在 37下預(yù)孵育培養(yǎng)板。b)3. 向各孔中加入各濃度的待測(cè)溶液c)10 l。4. 37下孵育。5. 向各孔中加入10 l的CCK-8溶液d)。6. 37下孵育

9、1-4小時(shí)。e)7. 測(cè)定450 nm處的OD值。a) 使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基制備50,000-100,000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。b) 建議使用CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)。c) 使用培養(yǎng)基或PBS來(lái)制備溶液。d) 如果待測(cè)溶液有還原性，測(cè)定不含細(xì)胞，但含有CCK-8的待測(cè)溶液在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，則可以直接加入CCK-8 ，如果吸光度相對(duì)較大，則需要除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的100 l培養(yǎng)基和10 l CCK-8進(jìn)行檢測(cè)。e) 白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。3). Annexin-V法檢測(cè)CNE-2細(xì)胞凋亡二、實(shí)驗(yàn)儀器和材料 Annexin V-FITC（膜

10、聯(lián)蛋白-V-FITC） 20g/ml 標(biāo)記緩沖液（Binding Buffe） 20 ml PBS（1×） 30 ml 量程分別為20l , 200l 和1000l的移液器及吸頭 微量離心管 可調(diào)速離心機(jī) 載玻片（用于熒光顯微鏡觀(guān)察），蓋玻片（用于熒光顯微鏡觀(guān)察） 去離子水，冰塊 流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡 三、實(shí)驗(yàn)方法 1凋亡細(xì)胞的制備：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg體重，10h后解剖取胸腺，分離胸腺細(xì)胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為2 ×106/ml，備用。 2200l細(xì)胞懸液加入1ml冷PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000rpm 4離心10分鐘，棄上清。 3重

11、復(fù)步驟2兩次。 4將細(xì)胞重懸于200l 標(biāo)記緩沖液。 5加入10l Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘或4反應(yīng)30分鐘。 6 加入300l標(biāo)記緩沖液，立即上機(jī)（流式細(xì)胞儀）或熒光顯微鏡觀(guān)察檢測(cè)。 四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用熒光顯微鏡觀(guān)察，凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜上可見(jiàn)黃綠色光環(huán)。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是調(diào)亡所特有的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。以FITC標(biāo)記的Annexin V, 可以同時(shí)結(jié)合使用PI(碘化丙啶)拒染法，用流式細(xì)胞儀分析可檢測(cè)凋亡細(xì)胞的百分率。 五、注意事項(xiàng) 1整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，切勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4下操作。 3反應(yīng)完畢后要盡快檢測(cè)，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，

12、反應(yīng)一小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開(kāi)始衰變。 4 Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)要注意避光。4). Tunel法及檢測(cè)CNE-2細(xì)胞凋亡(一)試劑配制1、磷酸緩沖液PBS(pH7.4)：磷酸鈉鹽 50mM,NaCl 200mM.2、蛋白酶K(200g/ml,pH7.4)：蛋白酶K 0.02g;PBS 100ml.3、含2%H2O2的PBS緩沖液(pH7.4)：H2O2 2.0ml;PBS緩沖液 98.0ml.4、TdT酶緩沖液(新鮮配)：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調(diào)節(jié)pH至 7.2,加ddH2O定容到1000ml;再加入二甲砷酸鈉 29.96g和氯化鈷0.238g.5

13、、TdT酶反應(yīng)液：TdT酶32l;TdT酶緩沖液 76l,混勻,置于冰上備用.6、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液：氯化鈉 17. 4g;檸檬酸鈉 8.82g;ddH2O 1000ml7、0.05%二氨基聯(lián)苯(DAB)溶液：DAB 5mg;PBS 10ml,pH7.4, 臨用前過(guò)濾后,加過(guò)氧化氫至0.02%.8、0.5%甲基綠(pH4.0)：甲基綠0.5g;0.1M乙酸鈉100ml.9、100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等.10、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體(ONCOR)(二)實(shí)驗(yàn)步驟1、標(biāo)本預(yù)處理：（有3種方法）a) 石蠟包埋的組織切片預(yù)

14、處理： 將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min； 用無(wú)水乙醇洗兩次，每次3min； 用95%乙醇洗一次，3min，再用75%乙醇洗一次，3min； 用PBS洗一次，5min； 加入蛋白酶K溶液(20ug/ml)，在室溫水解15min，去除組織蛋白； 用蒸餾水洗4次，每次2min，備用。b) 冰凍組織切片預(yù)處理： 將冰凍組織切片置10%中性甲醛中，置于室溫固定10min后，用濾紙吸去多余液體； 用PBS洗兩次，每次5min； 放入乙醇：乙酸(2：1)的溶液中，置于-20處理5min，用濾紙吸去多余液體； 用PBS洗兩次，每次5min，備用。c) 培養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理：

15、將約 5 × 107個(gè)/ml細(xì)胞置于 4%中性甲醛室溫中固定10min； 在載玻片上滴加 50-100l細(xì)胞懸液并使之干燥； 用PBS洗兩次，每次5min。備用。2、色缸中加入含2%過(guò)氧化氫的PBS,于室溫反應(yīng)5min.用PBS洗兩次,每次5min.3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周?chē)亩嘤嘁后w,立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液,置室溫15min.4、用濾紙小心吸去切片周?chē)亩嘤嘁后w,立即在切片上滴加 54l TdT酶反應(yīng)液,置濕盒中于37C反應(yīng) 1hr(注意：陰性染色對(duì)照,加不含TdT酶的反應(yīng)液).5、將切片置于染色缸中,加入已預(yù)熱到37的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液,于37保溫30min

16、,每10min將載玻片輕輕提起和放下一次,使液體輕微攪動(dòng).6、組織切片用PBS洗 3次,每次 5min后,直接在切片上滴加兩滴過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體,于濕盒中室溫反應(yīng)30min.7、用PBS洗4次,每次5min.8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05%DAB溶液,室溫顯色36min.9、用蒸餾水洗4次,前3次每次1min,最后1次5min.10、于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10min.用蒸餾水洗3次,前兩次將載玻片提起放下10次,最后1次靜置30s.依同樣方法再用100%正丁醇洗三次.11、用二甲苯脫水3次,每次2min,封片、干燥后,在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.(三)注意事項(xiàng)細(xì)胞凋

17、亡檢測(cè)試驗(yàn)中一定要設(shè)計(jì)陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣本?？梢圆捎貌患覶dT酶的作為陰性對(duì)照組，利用DNaseI部分降解的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組。(二)材料與試劑1.采用Boehringer Mannheim公司試劑盒，生物標(biāo)記的小鼠抗組蛋白單克隆抗體。2.過(guò)氧化物酶(-POD)標(biāo)記的小鼠抗DNA單克隆抗體3.鏈霉親合素包被的微孔板4.DNA-組蛋白復(fù)合物，作為陰性對(duì)照。5.ABTS底物6.溶解緩沖液7.溫育緩沖液8.底物緩沖液(三)樣品1.培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞的裂解物細(xì)胞裂解步驟：收集細(xì)胞，離心后，用200µl溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用30min。2.培養(yǎng)細(xì)胞的上清液3.血漿(血清)(四)操作方法

18、1.取樣品離心后(1 000r/min,10min),吸取20µl上清液，加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中。2.另加入80µl免疫反應(yīng)試劑含抗-DNA-POD、抗組蛋白-生物素及溫育緩沖液(按1118混合)，室溫下孵育2h(置搖床上，250r/min)。3.取上清，用300µl溫育緩沖液洗滌3次，小心移去洗滌液。4.加入100µl底物緩沖液，室溫下孵育使顏色變化至適合(置搖床上)。5.盡快作比色分析(10min20min內(nèi))，用底物緩沖液作空白對(duì)照，以波長(zhǎng)405nm，參考波長(zhǎng)492nm進(jìn)行檢測(cè)。(五)結(jié)果判定按下列公式計(jì)算細(xì)胞釋放的單/低聚核小體片段的特別聚集值：注：mU=吸收值(10-3)=雙孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若樣品的吸收值超過(guò)比色測(cè)定范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再檢測(cè)。5). ELISA