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1、1、一、常用的樣品制備技術(shù): 1、高豐度蛋白去除技術(shù)(抗體親和法:通過抗原抗體反應(yīng)原理,用針對樣品中多種高豐度蛋白的單克隆或多克隆抗體來特異性去除樣品中的高豐度蛋白;染料親和法:通過高豐度蛋白與染料環(huán)結(jié)構(gòu)之間復(fù)雜的靜電、疏水及氫鍵相互作用去除樣品中的高豐度蛋白,其特異性相對較低。)2、自由流電泳技術(shù)(FFE)(FFE分離原理IEF(等電聚焦)條件下:根據(jù)等電點的不同進行樣品分離,主要用于分離蛋白質(zhì)。ZE(區(qū)帶電泳)條件下:根據(jù)樣品表面電荷密度不同進行分離,主要用于分離細(xì)胞器。FFE的特點:1、是基于液體的樣品分離/制備技術(shù),與所有下游分離技術(shù)兼容;2、分離非常快;3、液相分離保證初始樣品具有很
2、高的回收率;4、采用連續(xù)模式,上樣和分離連續(xù)同時進行;5、分析對象廣泛;6、分離條件溫和,適合活性生物材料的分離純化。二、2DE技術(shù),即雙向電泳,是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分辨率最高、信息量最大的分離技術(shù)。它的優(yōu)點有:1. 可以將上千種不同的蛋白質(zhì)分離開來 ,并得到每種蛋白質(zhì)的等電點、表觀分子量和含量等信息。2.如果雙向電泳后續(xù)接一系列自動化操控,就能大大增加蛋白質(zhì)分析與鑒定的能力。3.可檢測翻譯后和翻譯過程的蛋白質(zhì)修飾。缺點有:1、不能進行可完全的2-DE分析。 2、許多較大的疏水蛋白質(zhì)在IEF分析中的結(jié)果不理想。3、對相對分子質(zhì)量過大()100000)的蛋白質(zhì)分離分析能力差 4、雙向電泳不易實
3、現(xiàn)自動化操作,不能適應(yīng)大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析的需要5、雙向電泳首先由的主要染色技術(shù)(考馬斯亮蘭染色、銀染色)的檢測靈敏度較差,且局限在越100倍的動態(tài)范圍,而細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達的動力學(xué)范圍為百萬倍,而且從膠上切割下的蛋白點消化后所產(chǎn)生的肽的回收率常常低于60%,這更會妨礙MS對低豐度蛋白的鑒定。二亞細(xì)胞組份的分離與鑒定。分離:最好的分級分離方法是亞細(xì)胞器的分離,然后對各細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組進行單獨研究。一般從三個方面對亞細(xì)胞器的純度進行評價:1電子顯微鏡檢測 2.標(biāo)志酶活性測定 3.Western blot質(zhì)膜的純度鑒定方法:質(zhì)膜的純度鑒定方法11、形態(tài)學(xué)方法(常規(guī)透射電鏡、免疫電鏡觀察其切片,純細(xì)胞膜
4、成空的膜泡或片狀結(jié)構(gòu))2免疫印跡法(常用抗體:抗caveolin、Na+-K+-ATPase、flotillin、5-nucleotidase等)3、酶活測定法(測 AP、ADP、Na+-K+-ATPase、5-nucleotidase的活性)4、膜組分分析法(分析脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的比例)由于細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)上與許多其他亞細(xì)胞組分相關(guān)聯(lián),和細(xì)胞器組成的動態(tài)性,所以分離得到的細(xì)胞器很難達到100% 的純度。所以,亞細(xì)胞組分的純度問題和亞細(xì)胞組分生物學(xué)功能的深入挖掘是亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究所面臨的挑戰(zhàn)?,F(xiàn)在已經(jīng)有一些研究策略來解決這一難點問題,如Schirmer等提出的差減蛋白質(zhì)組學(xué)方法來解決核膜的內(nèi)質(zhì)
5、網(wǎng)污染問題;Andersen 等提出的蛋白質(zhì)校正譜圖分析法(protein correlation profiling,PCP)來分析可能定位于中心體的蛋白質(zhì);Jiang 等運用ICAT 技術(shù)和生物信息學(xué)手段的方法來確證線粒體蛋白質(zhì),排除污染蛋白。三、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)就是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物研發(fā)中的應(yīng)用。藥物蛋白質(zhì)組學(xué)主要應(yīng)用于:(1)臨床前研究-發(fā)現(xiàn)所有可能的藥物作用靶點,以及針對這些靶點的全部可能的化合物,以及應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究藥物作用機制和毒理學(xué);(2)臨床研究方面-發(fā)現(xiàn)藥物作用的特異蛋白作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標(biāo)志物,或以蛋白質(zhì)譜的差異將患者分類并給予個體化治療。舉例:
6、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物靶點發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)中的應(yīng)用(1)研究人員通過比較給藥前后的蛋白質(zhì)組,找到了藥物阿霉素抗乳腺癌的一個作用靶標(biāo)Hsp27。(2)瘧原蟲入侵血紅細(xì)胞的阻斷靶點探測:半胱氨酸蛋白水解酶是瘧原蟲生存必需的酶,Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化學(xué)探針I(yè)125-DCG-04打靶,然后通過抗DCG-04的生物素純化,得到了半胱氨酸蛋白水解酶類的亞蛋白質(zhì)組;通過酶活性分析,最終發(fā)現(xiàn)在瘧原蟲的入侵血紅細(xì)胞的裂殖期,僅有一個有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白質(zhì)falcipain 1;從數(shù)據(jù)庫篩選到falcipain 1的抑制劑YA29-Eps,結(jié)果證實YA29-Eps可阻斷瘧原蟲的入侵紅
7、細(xì)胞。四、免疫共沉淀原理:當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時,完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x,那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。技術(shù)用途:1.鑒定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合,以及進行結(jié)合位點分析;2.篩選一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。優(yōu)點:相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài);蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的,可以避免人為的影響。缺點:1.需要高質(zhì)量的抗體進行IP;2.兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;3.檢測不到弱或瞬時的相互作用。Pull down 實驗原理:利用GST、HIS等標(biāo)簽
8、蛋白將一種蛋白質(zhì)(誘餌蛋白)固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose),當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過該基質(zhì)時,可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附,通過改變洗脫液或洗脫條件即可回收所吸附的蛋白。 用途:1.鑒定兩個已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用;2.篩選與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì)優(yōu)點:1.靈敏、周期短;2.不需要構(gòu)建基因文庫;3.抗體質(zhì)量要求不高;4.可鑒定直接相互作用。缺點:1.需要純化的蛋白;2.體外相互作用(假陽性、假陰性)。五、1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation) 2. 電泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝膠配制 (2)
9、樣品處理(3) 上樣與電泳3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer) 4. 封閉(Blocking) 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)7. 蛋白檢測(Detection of proteins)8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)六、質(zhì)譜儀的組成要件:樣品導(dǎo)入系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器四個部分。其中離子源又分為電子轟擊源、化學(xué)電離源、場致電離源、電噴霧電離源?;|(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜(Matrix Assisted Laser Desorption Io
10、nization / Time of Flight Mass Spectra),離子源是基質(zhì)輔助激光解吸電離,質(zhì)量分析器是飛行時間管。MALDI-TOF MS是近年來獲得快速發(fā)展的一種軟電離生物質(zhì)譜,它的建立突破了生物大分子質(zhì)譜分析的難題,該技術(shù)無論在理論上還是在設(shè)計上都具有簡單、高效、靈敏、快速、準(zhǔn)確、測定質(zhì)量范圍大等特點。肽質(zhì)量指紋譜(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)是蛋白質(zhì)被識別特異酶切位點的蛋白酶水解后得到的肽片段的質(zhì)量圖譜。由于每種蛋白的氨基酸序列(一級結(jié)構(gòu))都不同,當(dāng)?shù)鞍妆凰夂?,產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同,因此其肽質(zhì)量指紋圖也具有特征性。MALD
11、I-TOF-MS分析肽混合物時,能耐受適量的緩沖劑、鹽,而且各個肽片幾乎都只產(chǎn)生單電荷離子,因此MALDI-TOF成為進行分析PMF的首選方法。1.將待測樣品與基質(zhì)混合并置于樣品板上干燥。2. 將樣品板放入質(zhì)譜儀的樣品。3. 樣品點被激光脈沖照射,解吸,離子化 4. 離子被電場加速,進入真空漂移管5.離子的m/z不同,飛行時間不同,先后到達檢測器。6將分離得到的結(jié)果,與數(shù)據(jù)庫對比,得到肽質(zhì)量指紋譜后,再在數(shù)據(jù)庫中查詢鑒定蛋白質(zhì)。七、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展趨勢:隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展及其在多個領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用,其研究的發(fā)展重點也逐漸發(fā)生了轉(zhuǎn)變:1)從全蛋白質(zhì)組向鎖定特定目標(biāo)物的蛋白質(zhì)組研究轉(zhuǎn)變(
12、如亞細(xì)胞/功能蛋白質(zhì)組學(xué))。 2)從定性描述向定量分析轉(zhuǎn)變。3)由蛋白組研究向修飾蛋白組研究轉(zhuǎn)變。4)由體外研究向體內(nèi)研究轉(zhuǎn)變。5)從實驗室研究向臨床應(yīng)用拓展。6)數(shù)據(jù)產(chǎn)出由數(shù)量向質(zhì)量轉(zhuǎn)變。7)由簡單積累向有效整合以及知識挖掘轉(zhuǎn)變。8)發(fā)展新方法,同時,整合并存的各種方法,實現(xiàn)互補。9)蛋白質(zhì)組學(xué)與其它學(xué)科的交叉也將日益顯著和重要,這種交叉是新技術(shù)新方法的活水之源。面臨的挑戰(zhàn):1.蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過基因數(shù)目2.蛋白質(zhì)表達(種類和量)隨時、空而變3.每一蛋白質(zhì)并非只有一種分子實體(via PTM)4.沒有PCR等價物,難以對低豐度蛋白/多肽進行分析和比較5.氨基酸之間沒有堿基之間的專一性互補配對
13、關(guān)系6.經(jīng)過質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)還需要傳統(tǒng)的方法來驗證。因此,當(dāng)前的主要任務(wù)是發(fā)展高通量、高靈敏度和高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺。八?血漿/血清蛋白質(zhì)組研究中需要著重注意的問題1、樣品的選擇 (分析低分子量的蛋白質(zhì)時:適于選用去除血小板的EDTA血漿或枸櫞酸血漿樣品)2、樣品的收集與貯存(選擇:抗凝劑種類,血清凝集時間,血漿孵育時間和溫度)3、去除高豐度蛋白和分級技術(shù)(高豐度蛋白嚴(yán)重干擾了低豐度蛋白的檢測高豐度蛋白的去除策略抗體親和法:利用抗原抗體反應(yīng)的原理,用針對血漿中多種高豐度蛋白的單克隆或多克隆抗體來特異性去除血漿中的高豐度蛋白染料親和法:通過高豐度蛋白與染料環(huán)結(jié)構(gòu)之間復(fù)雜的靜電、疏水及氫鍵、相互
14、作用去除血漿中的高豐度蛋白。特異性相對較低。)4、多維策略的運用聯(lián)合使用不同技術(shù)平臺并加以適當(dāng)改進是目前最通用的手段:主要包括:去除高豐度蛋白、樣本預(yù)分離系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)九: 1、腫瘤標(biāo)志物研究的策略和方法樣本收集;分離和鑒定;表達驗證;功能驗證 經(jīng)典的2-DE在一定范圍內(nèi)得到應(yīng)用,能直接比較蛋白質(zhì)水平的差異。 直接質(zhì)譜法之色譜-質(zhì)譜聯(lián)用:蛋白酶解為多肽,再鑒定和定量這些多肽,即可獲得原始蛋白的質(zhì)和量的信息;包括標(biāo)記法和非標(biāo)記法;該操作相對簡單;但,由于原始蛋白的一些信息會在酶解時丟失 (如蛋白降解),其結(jié)果是不全面的 直接MALDI(基質(zhì)輔助激光解吸電離)SELDI(表面增強激光解吸電離),即不酶解,直接進行質(zhì)譜分析; 更適用于高通量研究,但是后續(xù)的蛋白質(zhì)多肽鑒定往往成為這類實驗的瓶頸其它方法:包括基于抗體的方法,如自身抗體、抗體芯片等。如: 血清蛋白組學(xué)分析:即分別用病人和正常人的血清作為一抗,篩選腫瘤組織中的差異蛋白質(zhì),即腫瘤抗原。其實質(zhì)是 2DE + 免疫印跡技術(shù) 流程: 腫瘤組織或細(xì)胞總蛋白2DE分離轉(zhuǎn)膜膜與病人血清及對照血清反應(yīng)質(zhì)譜鑒定差異反應(yīng)點的蛋白確定腫瘤抗原病人血清及對照血清:差異的就是前者有針對腫瘤抗原的抗體(1
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