免疫實(shí)驗技術(shù)

1、流式細(xì)胞技術(shù)1.流式細(xì)胞技術(shù)的特點(diǎn)及影響因素：特點(diǎn)：“六高一低” 高精度、高速度、高靈敏度、高純度、高效率、高科技含量 低分辨率影響因素：“三穩(wěn)定一確?！?細(xì)胞熒光染色的實(shí)驗條件要穩(wěn)定 正交光電測量系統(tǒng)要穩(wěn)定 鞘液流速系統(tǒng)要穩(wěn)定 確保細(xì)胞懸液分散均勻，不得混有過量的雜質(zhì) 2.流式細(xì)胞分析技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用：1.細(xì)胞表面分子分析（淋巴細(xì)胞分型/白細(xì)胞分型）2.DNA含量、細(xì)胞周期/細(xì)胞凋亡的檢測與分析3.血小板及其活化分析4.胞內(nèi)蛋白質(zhì)分析（細(xì)胞因子/轉(zhuǎn)染率檢測）5.可溶性蛋白質(zhì)檢測（CBA法）6.細(xì)胞功能分析7.其他（牛奶微生物檢測）流式細(xì)胞儀包括:光學(xué)系統(tǒng),液流系統(tǒng),數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),檢測

2、系統(tǒng)原理:經(jīng)染色的細(xì)胞或微球在懸液中以單行流過高強(qiáng)度光源的焦點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞或微球經(jīng)過焦點(diǎn)時,發(fā)出一束散射光和(或)熒光，并經(jīng)過濾光鏡系統(tǒng)收集到達(dá)一個光電檢測器,光電檢測器把光信號定量轉(zhuǎn)化成電信號，經(jīng)數(shù)字轉(zhuǎn)換器進(jìn)行數(shù)字化后而成整數(shù)，然后進(jìn)行電子存儲數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以直方圖，二維散點(diǎn)圖，等高線圖，灰度圖以及三維圖等多種形式顯示,分析。流式細(xì)胞步驟：1、 每組取兩個EP管，分別標(biāo)記為ISO（對照組）和TEST（實(shí)驗組），每管加入100uL全血；2、 在TEST管中加入5uL的實(shí)驗抗體（CD4-FITC,CD8-PE），ISO管中加入5uL的同型對照抗體，室溫避光20min；3、 加入1mL紅細(xì)胞裂解液，混勻靜

3、置5min，再次混勻后靜置3min，200g離心5min，去上清，每管中加入PBS洗液1mL，混勻后離心5min；4、 重復(fù)洗滌一次，每管加入200uL洗液重懸，轉(zhuǎn)入流式專用測試管。單細(xì)胞懸液的制備技術(shù)定量細(xì)胞學(xué)熒光染色技術(shù)定量細(xì)胞學(xué)熒光染色的質(zhì)量容易受到多種因素的影響，從而帶來分析結(jié)果的誤差，最主要的影響因素有：溫度效應(yīng)、pH效應(yīng)、濃度效應(yīng)、溶劑效應(yīng)派若寧及其染色技術(shù)ELISA基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體

4、按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。 ELISA常用的四種方法1直接法測定抗原 將抗原吸附在載體表面；加酶標(biāo)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物；加底物。底物的降解量抗原量。  2間接法測定抗體將抗原吸附于固相載體表面；加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物；加酶標(biāo)抗體；加

5、底物。 測定底物的降解量抗體量。 3雙抗體夾心法測定抗原將抗原免疫第一種動物獲得的抗體吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物; 加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物;加酶標(biāo)抗體（第二種動物抗體的抗體）; 加底物。底物的降解量抗原量。 4. 競爭法測定抗原將抗體吸附在固相載體表面;（1） 加入酶標(biāo)抗原；（2）,（3）加入酶標(biāo)抗原和待測抗原；加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。 5捕獲包被法測抗體：目前，常用的IgM抗體檢測方法為捕獲法，即以抗人IgM抗體(抗人u鏈)作為固相抗體，當(dāng)加入血清標(biāo)本時，其中的IgM類抗體(特異的和非特異的)即可被

6、固相抗體捕獲，再加入特異抗原，其與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合后，加入酶標(biāo)抗特異抗原的抗體，最后加入底物顯色 6.ABS-ELISA法ELISA的應(yīng)用1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。 2、研究抗酶抗體的合成。 3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。ELISA的優(yōu)點(diǎn)具有靈敏度高,特異性強(qiáng),操作簡單,觀察結(jié)果容易,便于大規(guī)模檢測的特點(diǎn).既可定性,也能定量,還可以定位,為一種頗為理想的微量測定技術(shù),已經(jīng)廣泛用于各種抗原抗體的檢測和研究.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗原理：淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，受到抗原的刺激后可表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加，即向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖

7、。此現(xiàn)象稱為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象（簡稱為淋轉(zhuǎn)）。PBMC分離基本原理：由于血液標(biāo)本中各種細(xì)胞比重不同，紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比重為1.092，單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）比重為1.0751.090；Ficoll比重為1.077±0.001。將血液標(biāo)本置于分層上，經(jīng)離心沉淀，比重高的紅細(xì)胞、多核白細(xì)胞沉于管底，而比重小的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞懸浮于血漿和分層液的界面層中。細(xì)胞濃度(個/ml)=(4個大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)細(xì)胞總數(shù)(個)=細(xì)胞濃度×細(xì)胞懸液體積(ml)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗流程-注意事項：1.所有過程均需注意無菌操作，動作盡量快且輕柔2.

8、加入稀釋血至分離液上層時請注意勿攪亂分層液液面。3.密度梯度離心過程中不能用離心機(jī)“剎車”檔，以保持分層界面清晰4.細(xì)胞計數(shù)前一定要將離心后細(xì)胞重懸成單個細(xì)胞懸液5.加入MTT并繼續(xù)培養(yǎng)后一定要小心輕放細(xì)胞培養(yǎng)板，小心吸去上清以免吸去細(xì)胞6.加入DMSO后要混勻讓甲臜顆粒充分溶解。蛋白質(zhì)免疫印記基本原理：在電場作用下將電泳分離的蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移至固相載體，用識別此多肽的抗體進(jìn)行檢測步驟:蛋白樣品的制備-制膠(先制分離膠后制積層膠)-上樣-電泳-電轉(zhuǎn)移-抗體雜交及顯示應(yīng)用：1.檢測樣品中的蛋白。基于：被測蛋白與抗體的特異性結(jié)合以及蛋白質(zhì)的相對分子量2.未知抗原與已知蛋白的關(guān)系3.評價新抗體的特性4

9、.蛋白質(zhì)酪氨酸殘基是否發(fā)生磷酸化5.不能用于檢測蛋白質(zhì)的生化特性、化學(xué)修飾或半壽期SDS的作用：1.SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.2.當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.3.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位), SDS 帶強(qiáng)負(fù)價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,變性的多肽與SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷因此SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小有關(guān)樣品的制備 樣品緩沖液的配制1.SDS:斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu).2.巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT):使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂.3.甘油:比重大4.溴酚藍(lán):指示劑5.緩沖液轉(zhuǎn)移方向陰極-濾紙(2層)凝膠NC膜濾紙(2層)-正極內(nèi)參照：評價各個上樣孔內(nèi)胞內(nèi)蛋白的總量是否基本一致通常使用一些看家蛋白，比如-actin、GAPDH等等這些蛋白在所有細(xì)胞中的表達(dá)量基本一致，而且很少受外界因素影響而發(fā)生變化，所以用他們來作為加樣量的對照。目的蛋白經(jīng)過處理后發(fā)生變化，而內(nèi)參的條帶基本均勻一致。這樣才有說服力，表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或是人為造成目的條帶濃度的變化。嚴(yán)格