中藥活性指標成分阿克苷制備與鑒定

1、附件1中藥活性指標成分阿克昔(acteoside)的制備與鑒定何江j胡小鵬2,邱榕珠彳,馬文杰彳，李濤21. 深圳大學醫(yī)學院2. 深圳大學生命科學學院3. 深圳大學化學與化工學院摘要：本實驗以苦丁茶木犀科植物紫莖女貞(ligustrum purpurascens)葉為原料, 通過高效快速的分離純化方法，制備得到口標化合物。口標化合物經結構鑒定為 阿克苛(acteoside )<>關鍵詞:阿克昔紫莖女貞制備鑒定概述阿克昔(acteoside),又名洋丁香酚昔(中華本草)、洋丁香昔(中藥辭海)、 毛蕊花昔、馬鞭草昔、麥角當昔等。1963年羅馬大學，m. l. scarpati首先報 道

2、從植物verbascum sinuatum 'i1分離到阿克昔(acteoside)。根據現有的 文獻查詢分析，阿克甘廣泛分布于雙子葉植物中，含阿克甘的植物包扌乩 唇阿克昔(acteoside)分子結構形科(labiatae) 15 屬 41 種，紫薇科(bignoniaceae) 4 屬 5 種，木犀科(oleaceae)7 屬 12 利列當科(orobanchaceae) 5 屬 10 種,玄參科(scrophulariaceae) 21 屈34種，馬錢科(loganiaceae) 2屬7種，馬鞭草科(verbenaceae) 12屈31 種，車前科(plantaginaceae)

3、 2屬7種,爵床科(acanthaceae) 2屬3種，木蘭 科(magnoliaceae) 1 屬 2 種，苦檻藍科(myoporaceae) 1 屬 1 種,蓼科(polygonaceae) 1屬1屬，菊科(compositae) 1屬1種，胡麻科(pedaliaceae) 1屬1種，桔梗 科(campanulaceae) 1屈1種，胡椒科(piperaceae) 1屈1種，苦苣苔科(gesneriaceae) 1屬1種，薔薇科(rosaceae) 1屬1種,共計79屬160種植物。 現代藥理研究表明阿克昔具冇多種生理活性：抗氧化，抗病毒，保肝，抗腫瘤 轉移，抗炎，降血脂，抗菌，神經保護，

4、降血壓和心血管保護等。由于阿克昔 具有多種生理活性，口分布廣泛，資源豐富，因此對其費用價值的研究己成為天 然藥物研發(fā)的新熱點。阿克莒屈新一類天然活性結構分子，隨著藥理研究的不斷 深入，必將為其帶來廣泛的臨床應用前景。阿克昔為苯丙索昔類成分，可溶于醇類有機溶劑，溶于水，極性大，阿克昔 分子結構對熱和光不穩(wěn)定，分離純化難度大。探索高效快速制備和鑒定的方法， 有益于阿克苛的藥物研究和開發(fā)。實驗部分一、實驗儀器及試劑比旋度j20c旋光光譜儀測定，紫外光譜用uv210a型紫外光譜儀測定, 紅外光譜用ir-450型紅外光譜儀測定，核磁共振譜用wh-400型核磁共振儀 測定，fab-ms用jabiis測定。

5、層析柱材料用硅膠，d101人孔吸附樹脂，sephadex lh-20o薄層層析用高效 硅膠 g 板(hptlc, silica gel, merck),展開劑為 chc13meohh2o (7:3:05)。 有機溶劑用甲醇，乙醇和氯仿等。二、捉取及分離稱量482.3 g干燥的苦丁茶紫莖女貞(ligusfrum purpurascens)葉,剪碎， 放入10 l加熱回流提取磨口器皿中，加入5lmeoh,加熱回流2小時后，靜置 放涼，然后過濾，得提取液h1；隨后，再重復操作一次，得提取液h2(提取流 程見圖l)o合并兩次提取液hl和h2,并減壓濃縮，得甲醇提取物395.5 g。在 甲醇提取物395

6、.5 g中加入4l純凈水，充分攪拌混勻，然后靜置一小時，濾岀 上清液，如此反復操作三次，將所得的上清液合并，并直接上d101樹脂(1500g)層析柱分離。d101樹脂層析柱分別用純凈水、50%甲醇和甲醇洗脫，得到三 組憾分:a (23.5 g), b (57.8 g)和 c(11.3g)。所得 a、b、c 三部分，經 tlc 檢 測硅膠g,展開系統(tǒng)chclsmeohh2o (7:3:0.5),b部分含有阿克昔。b部分(57.8 g)經硅膠層析，干柱切割法，得到三部分：e(7.8g)、f(12.1) 和g(31.5 g)o將含冇阿克苜的f部分進行硅膠柱層析，以chclameohh2o 溶劑系統(tǒng)洗

7、脫得到7組懈分(如圖1所示)。其中f3部分(3.2 g)再進行一次硅 膠柱層析分離，得到粗品m 2.8 go粗品m再經sephadex lh-20柱層析純化得到 m 1.9 go苦丁茶葉482.3 g|meoh (51x2)meoh提取物395.5 gi h2o (4 £ x 3)水不洛物283.4 gd101大孔吸附樹脂層析h2o-meoh meohabc23.5 g57.8 g 11.3 g硅膠層析(切割法)chcirmeoh-h2o.7:3:0.5efg7.8 g12.1 g 31.5 g硅膠層析chci3-meoh-h2o.m 洗骯flf2f3f4f5f632g|硅膠層析ch

8、ci3.meoh-h2o.梯度洗脫2.8 g| sephadex lh-20. 95% etohm1.9g圖1阿克昔提取及分離純化三、純度檢測經色譜層析純化得到的m (1.9 g),其純度進行高效液相(hplc)檢測。檢測 條件為：1. 儀器：安捷倫1200 (agilent 1200)高效液相儀2. 檢測波長:227 nm3. 分析柱：c-18 column (hypersil ods, 250x4.6 mm)4. 柱溫：4°c5. 流速：1 ml/min6. 樣品濃度：1 mg/ml7. 進樣量：5卩18. 洗脫條件：起始洗脫比例為h2oacetonitrile (80:20,v

9、/v);時間程序為025 min,洗脫比例由 0100% acetonitrile12.5圖2 m的高效液相純度檢測通過高效液相色譜檢測，從苦丁茶紫莖女貞葉中分離純化得到的m其純度 為 97.3%o四、結構鑒定1. 顯色反應1) fecb顯色：將少許m試樣溶于10 ml適量的甲醇屮，用毛細管取樣，并在 硅膠tlc板上點樣，用風筒將斑點吹干，然后用10% fecl3水溶液在tlc上噴 霧，此時觀察到斑點呈墨蘭色。2) koh水溶液顯色：取少許m試樣放入一小試管中，用甲醇溶解，然后滴加 10% koh水溶液二至三滴，溶液呈深黃色。2. 比旋度測定:ad2463.23 (c 0.348, meoh)

10、3. 紫外光譜xmax (etoh) nm, (log e)(如圖3所示)在210240 nm區(qū)間，出現225 (4.32)和248 (3.80)吸收，表明化合物m 結構中含有oc、卩不飽和?；捅江h(huán)官能團。288 (4.05)為苯環(huán)的弱吸收貳，而 335 (4.18)吸收為結構屮的兀tti*電子躍遷的吸收帶峰。圖3化合物m的紫外吸收光譜4. 紅外光譜ircm"1 (如圖4所示)3450吸收寬峰表明m分子中存在多一oh基團，1690與1660為共軌a、p不飽和?；奶卣魑辗?，1510和1440為雙鍵和苯環(huán)骨架振動吸收。20 060 jj40.020 00.04000 03000 0

11、260001500.010000400.0 cm1圖4化合物m的紅外吸收光譜5. nmr核磁共振譜如圖5所示，化合物m的lhnmr譜圖在6.517.03 ppm低磁場共振范 圍內岀現6個苯環(huán)質子信號，屬于兩個abx自旋系統(tǒng)。56.24和7.56的兩組二 重峰,j= 16.0 hz,為咖啡?；姆词诫p鍵質子信號；而53.26 (2h, j = 6.0 hz)> 3.78 (lh,t,j = 9.1 hz)和3.91(lh,m)分別為苯乙醇基質子信號。在*hnmr 譜中可觀察到卩d 葡萄毗南糖基和ocl 鼠李毗喃糖基的端基質子信號。化合物m的】hnmr化學位移信號歸屬如下：aglycone

12、(3,4-dihydroxyphcnylcthyl): 6.67 (1h, d, j = 2.0 hz, h-2), 6.65 (1h, d,丿=8.1 hz, h-5), 6.51 (1h, dd, j=8.1, 2.0 hz, h-6), 3.26 (2h, t, j = 6.0 hz, h2-7), 3.78 (1h, t,丿=9.1 hz, h-a), 3.91 (1h, m, h-8b)glucosyl: 4.33 (1h, d, j = 7.9 hz, h-lz), 3.583.47(m, 20 and 5'), 4.89 (1h, t, j = 9.4 hz, h4

13、9;),3.68 (1h, dd, j= 12, 5.1 hz, h6)，3.96 (1h, dd? j= 12, 2.0 hz,h6)rhamnosyrr5.16 (ladkm 1.4 hnhl=)“ 3583.4739 2= and 3=)9 3.36 (1® l j h xoohn3.26 (m“ h5、) 106 (3hv dv j h 6.3 hnh36=) cafrcoyrr703 (1h “ d“ j h 2.0 hz “ hz) 6.75 (1h9 dd j n 8.2 hz “ h5jv 6.90 (ihkdl h 82 2.0 hzv h6jv 7.56 (ihk

14、l 丄 6.0 hz “ h7) 6.24 (ihka j h 812.0 hnh.8j756(hdjus.o hzh.7jif.5.16lhdj"4hzh-二)68uhddju822.0 hzh6)7.03(h djh2ohzh.2j396=hddjmk32ohzh-6)30uhmhs3 78ohajh9hzh8)3 58l3 47 (mh2352=3)489 suhi.jh 9 4 hzh) (1h djh 79 hzh二3 36(-hc=8 8hzh,4)-r3 26(mh5j 3滾qhj jh6ohzh2,7)6.67 uhd ：2ohzh-2)665(lhdj=8l hth

15、.5) (1h ddj"12 5.1 hz h-6)6 51(lhddj=8-20hzh-6)sok函 5 m 妄一h nmr sqhdju6.3hzh6)6. 13cnmr核磁共振譜化合物m的叱nmr圖譜(見圖6)顯示29個碳信號，與文獻報道數據比較，其碳 化學位移信號得到歸屬：aglycone (3,4-dihydroxyphcnylcthyl): 131.5 (c-l), 116.3 (c-2), 144.4 (c-3),146.5 (c-4), 117.1 (c-5), 121 (c-6), 36.3 (c7), 72.0 (c-8)glucosyl: 102.8 (gluc

16、-lr), 75.7 (gluc2)，81.6 (gluc-3r), 70.2 (gluc4)，76.0 (gluc-59, 62.2 (gluc-69,rhamnosyl: 104.0 (rhac-l"), 72.0 (rhac-2")? 72.2 (rhac-3"), 73.7 (rhac-4"),70.5 (rhac-5"), 18.3 (rhac-6")cafteoyl: 127.6 (cl")，115.3 (c2")，145.9 (c3')，149.5 (c4')，116.5(c5'

17、;)，123.2 (c6)，147.9 (c7")，114.6 (c8")c-1 c-1m131 5127 6c-6-123.2c-4,h149.5c-7m,147.9c41465c-3m,145.9c-3144.4co168 3150c-5117.1嚴116.3/ gluc-3* /c-2-81.6115.3rhac-t104 0gluc-2*75.772.2, rhac-3h72.0. rhac-2h72.0. c-8j gluc4'70.2rhac-4mrhac-5”70 5gluc5'76.0rhac-6m18.3c-7363gluc-v102 8t

18、oogluc6'62.20圖6化合物m的13c nmr圖譜7. fab-ms 譜圖化合物m的fab-ms圖譜顯示，亞分子離子峰m+h+為625,分子式可推定為c29h36o15o圖7化合物m的fab-ms圖譜&結果以苦丁茶紫莖女貞為原料，經捉取純化，得到化合物m1.9 g,經hplc測定，其純 度為97.3%o通過以上物理化學性質和波譜學的數據進行結構推定，化合物m的分子結構應為：2 ( 3, 4二甕基苯)乙基一30al-訊李毗喃糖基40丿乂式咖啡酰 基一0卩一d葡萄毗喃糖甘，即該化合物m與已知成分阿克甘(acteoside) 一致。討論按照課題立項的要求，現已如期完成。從苦丁茶紫莖女貞葉屮分離得到口標化合物 阿克1.9 g,純度為97.3%,所分離純化得到的阿克甘結構經波譜學和化學方法得到鑒 定。阿克昔為天然多酚類成分，極性大，分了結構對熱和光皺感，不穩(wěn)定，分離純化難 度大。針對阿克昔分了極性大，不穩(wěn)定，分離難度大的具體問題，我們應用新方法，大 大提高了阿克昔的分離純化速度和效率。所采用的新方法冇：1）在本實驗中采用浸膏水 萃取法，克服以往混懸水相親脂溶劑梯度萃取法吋間長、易乳化、成分交叉等問題；2） 將浸膏水萃取的上清液，直接加樣進行大孔吸附樹脂