DNA重組及重組DNA技術(shù)

1、1會計學(xué)DNA重組及重組重組及重組DNA技術(shù)技術(shù)第一節(jié)第一節(jié)自然界自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移重組和基因轉(zhuǎn)移DNA Recombination and Gene Transfer in NatureDNA重組重組同源重組同源重組 (homologous recombination)位點特異的重組位點特異的重組(site-specific recombination)轉(zhuǎn)座重組轉(zhuǎn)座重組(transposition recombination)接合作用接合作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction) 發(fā)生在同源序列間的

2、重組稱為發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組同源重組(homologous recombination)，又稱又稱基本重組基本重組（general recombination）。是最基本的。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。段的交換。 以以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的同源重組為例，了解同源重組機制的的Holliday模型模型一、同源重組是最基本的一、同源重組是最基本的DNA重組方式重組方式片段重組體片段重組體(patch recombinant)

3、拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 一個一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；中間體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：，分別為： 片段重組體片段重組體 （見模型圖左邊產(chǎn)物）：（見模型圖左邊產(chǎn)物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組 體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本本DNA。

4、 拼接重組體拼接重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：（見模型圖右邊產(chǎn)物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。 內(nèi)切酶內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_侵?jǐn)_(recA)分支遷移分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶連接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holliday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 Holliday中間體中間體5 3

5、5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶片段重組體片段重組體拼接重組體拼接重組體二、位點特異重組是發(fā)生在特異位點二、位點特異重組是發(fā)生在特異位點間的間的DNA整合整合 位點特異重組位點特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩是由整合酶催化，在兩個個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。序列的特異位點間發(fā)生的整合。噬菌體的整

6、合酶識別噬菌體和宿主染噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒病毒cDNA的的長末端重復(fù)序列長末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）（一）噬菌體噬菌體DNA的整合的整合（二）細菌的特異位點重組（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。 hix為反向重復(fù)序列，它們之間的為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段片段可在可在Hin控制下進行特異位點重組控制下進行特異位點重組(倒位倒位)

7、。H片段上有兩個啟動子片段上有兩個啟動子P，其一驅(qū)動，其一驅(qū)動hin基基因表達，另一正向時驅(qū)動因表達，另一正向時驅(qū)動H2和和rH1基因基因表達，反向表達，反向(倒位倒位)時時H2和和rH1不表達。不表達。rH1為為H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重組酶重組酶轉(zhuǎn)位片段轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA啟動序列啟動序列H1啟動序列啟動序列沙門氏菌沙門氏菌H H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈，由兩條輕鏈(L鏈鏈)和兩條重和

8、兩條重鏈鏈(H鏈鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈其中兩個編碼輕鏈( 和和 )，一個編碼重鏈。，一個編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 重鏈重鏈(IgH)基因的基因的V-D-J重排和輕鏈重排和輕鏈(IgL)基基因的因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在重排均發(fā)生在特異位點上。在V片片段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的兩側(cè)片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列均存在保守的重組信號序列(recombination signal sequence, RS

9、S)。此重排的重組酶基。此重排的重組酶基因因rag (recombination activating gene)共有共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號序列重組信號序列基因片段基因片段免疫球蛋白基因重排過程免疫球蛋白基因重排過程三、轉(zhuǎn)座重組三、轉(zhuǎn)座重組可使基因移位可使基因移位 由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為排稱為轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座(transposition)。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個大多數(shù)基因在基因組

10、內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的位置移動到另一位置。這些可移動的DNA序列包括插入序列和序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子。 插入序列插入序列(insertion sequences, IS)組成：組成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座（一）插入序列轉(zhuǎn)座 二個分離的反向重復(fù)二個分離的反向重復(fù)(inverted repeats, IR)序列序列 特有的正向重復(fù)序列特有的正向重復(fù)序列 一個轉(zhuǎn)座酶（一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因編碼基因插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座保守性轉(zhuǎn)座(conservati

11、ve transposition) 復(fù)制性轉(zhuǎn)座復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition)插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個染色體可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成：轉(zhuǎn)座子組成： 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因 細菌的可流動性元件細菌的可流動性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列插入序列：轉(zhuǎn)座

12、酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、：含有轉(zhuǎn)座酶、-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座四、原核細胞可通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)四、原核細胞可通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進行基因轉(zhuǎn)移或重組進行基因轉(zhuǎn)移或重組（一）接合作用（一）接合作用當(dāng)細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互當(dāng)細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至另一細胞（細菌）的移至另一細胞

13、（細菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為轉(zhuǎn)移稱為接接合作用合作用(conjugation)。 可接合質(zhì)粒如可接合質(zhì)粒如 F 因子因子(F factor) 細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。分子。 質(zhì)粒質(zhì)粒（二）轉(zhuǎn)化作用（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外通過自動獲取或人為地供給外源源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。例：例：溶菌時，裂解的溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。片段被另一細菌攝取。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細胞釋放當(dāng)病毒

14、從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移及基因重組即為及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。噬菌體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長途徑溶菌生長途徑 (lysis pathway)溶源菌生長途徑溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway)第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)Recombinant DNA Technology重組重組DNA技術(shù)的發(fā)展史技術(shù)的發(fā)展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。的豌豆雜交試驗。1944年年

15、O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。1973年年 美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子。分子。1977年年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。藥物。1980年年 開始建造第一家應(yīng)用重組開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉。英國羅林研究所成功的克隆了多莉。重組重組DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念 克隆

16、克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。貝的集合。 獲取同一拷貝的過程稱為克隆化獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。，即無性繁殖。 DNA克隆克隆技術(shù)水平：技術(shù)水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克?。┛寺。?細胞克隆細胞克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮﹤€體克?。▌游锘蛑参铮┢渲饕^程包括：在體外將目的其主要過程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元片段與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組件（又叫載體）連接，形成重組DNA分子，進而在受體細胞中復(fù)制、擴增分子，進而在受體細胞

17、中復(fù)制、擴增，從而獲得單一，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。分子的大量拷貝。 重組重組DNA技術(shù)，又稱分子克?。夹g(shù)，又稱分子克隆（molecular cloning）或）或DNA克?。寺。―NA cloning）或基因工程（）或基因工程（genetic engineering）技術(shù)）技術(shù) 目的：目的： 分離獲得某一感興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶

18、連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接；分子或片段連接；缺口平移制作高比缺口平移制作高比活探針；活探針； DNA序列分析；序列分析；填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DN

19、A 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA；替代替代DNA聚合酶聚合酶I進行填補，標(biāo)記或進行填補，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是一類核酸內(nèi)切酶，能識別雙鏈?zhǔn)且活惡怂?/p>

20、內(nèi)切酶，能識別雙鏈DNA分子分子內(nèi)部的特異序列內(nèi)部的特異序列, 并裂解磷酸二酯鍵。并裂解磷酸二酯鍵。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H定義：定義：與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身，保護自身DNA。、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）分類：分類：作用：作用：第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序

21、。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：命名：Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口黏端切口黏端切口有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為

22、同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍末端伍末端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶來源不同的限制酶，但能識別和切割來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同一位點，這些酶稱同裂酶或同功異源酶同裂酶或同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同裂酶：同裂酶：名稱名稱 識別序列及切割位點識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點名稱識別序列及切割點

23、切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后產(chǎn)生平末端切割后產(chǎn)生平末端:A

24、lu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶 二、重組二、重組DNADNA技術(shù)中常用的載體技術(shù)中常用的載體 定義定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。分子。 載體按功能分為載體按功能分為 克隆載體克隆載體(cloning vector) 表達載體表達載體(expression vector) 克隆載體克隆載體(cl

25、oning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴增而特意序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為設(shè)計的載體稱為克隆載體克隆載體。 表達載體表達載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計的多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為載體稱為表達載體表達載體。（一）克隆載體（一）克隆載體1. 1. 克隆載體應(yīng)具備的基本特點克隆載體應(yīng)具備的基本特點 （1 1）質(zhì)粒）質(zhì)粒 (plasmid)特點特點: : 能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會賦予宿主細胞一些遺傳性

26、狀。會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 2. 常用的克隆載體常用的克隆載體 pUC18質(zhì)粒載體圖譜質(zhì)粒載體圖譜 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克?。┛寺。?EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┫盗校ㄖ脫Q型，適用基因組克?。? 2）噬菌體）噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體）載體（又稱黏粒載體） 酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細菌人工染

27、色體細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動物病毒動物病毒DNA改造的載體改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（3）其他克隆載體）其他克隆載體 原核表達載體的基本組成原核表達載體的基本組成 R R：調(diào)節(jié)序列；：調(diào)節(jié)序列；P P：啟動子；：啟動子；SDSD：SDSD序列；序列；TTTT：轉(zhuǎn)錄終止序列：轉(zhuǎn)錄終止序列 真核表達載體的基本組成真核表達載體的基本組成 OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點； TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。第三節(jié)第三

28、節(jié)重組重組DNA技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理和操作步驟和操作步驟基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細胞導(dǎo)入受體細胞外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達克隆基因的表達 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。序列。組織或細胞染色體組織或細胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)

29、切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合 從基因組從基因組DNA文庫獲取目文庫獲取目的基因的基因限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA

30、 片段片段 基因文庫基因文庫用隨機切割的真核生物染色體用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫片段構(gòu)建基因文庫 mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)制復(fù)制 從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T（二）載體的選擇與構(gòu)建（二）載體的選擇與構(gòu)建選選目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。不同。 目的：目的：

31、 獲得某一目的基因或獲得某一目的基因或DNA片段片段 獲得目的獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)片段所編碼的蛋白質(zhì)載體載體插入插入DNA片段片段宿主細胞宿主細胞質(zhì)粒質(zhì)粒510kb細菌，酵母細菌，酵母噬菌體載體噬菌體載體20kb細菌細菌黏粒黏粒50 kb細菌細菌BAC400kb細菌細菌YAC3 Mb酵母酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細胞不同載體的克隆容量及適宜宿主細胞 （三）目的（三）目的DNA與載體連接與載體連接接接方式：（方式：（1）單一相同黏端連接單一相同黏端連接 （2 2）不同黏端連接不同黏端連接 （3）通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接 1. 黏端連接黏端連接Ba

32、m H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連單一相同黏端連接單一相同黏端連接不同黏端連接（定向克?。┎煌ざ诉B接（定向克隆

33、）GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點Bg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體由平端加上新的酶切位點，再用限制由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。 人工接頭人工接頭(linker)連接連接通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接通過其他措施產(chǎn)生黏端

34、進行連接人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R在末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 的作的作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。造出粘性末端，再進行粘端連接。 同聚物加尾連接同聚物加尾連接5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外

35、切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體5 2. 平端連接平端連接 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：適用于：目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連受體菌條件：受體菌條件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(co

36、mpetent) 導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重組（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞轉(zhuǎn)入受體細胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)1. 借助載體上的遺傳標(biāo)志進行篩選借助載體上的遺傳標(biāo)志進行篩選 (1) 利用抗生素抗性標(biāo)志篩選利用抗生素抗性標(biāo)志篩選(2) 利用基因的插入失活利用基因的插入失活/插入表達插入表達 特性篩選特性篩選(3) 利用標(biāo)志補救篩選利用標(biāo)志補救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進行篩選利用噬菌體的包裝特性進行篩選（五）重組體的篩選與鑒定（五）重組體的篩選與鑒定篩篩2. 序列特異性篩選序列特異性篩選 (1) R

37、ERE酶切法酶切法(2) PCR法法 (3) 核酸雜交法核酸雜交法(4) DNA測序法測序法 3. 親和篩選法親和篩選法插入失活篩選帶有重組載體的克隆插入失活篩選帶有重組載體的克隆 互補篩選（藍互補篩選（藍- -白篩選）白篩選） 菌落或噬斑原位雜交篩選重組體菌落或噬斑原位雜交篩選重組體 重組重組DNADNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：技術(shù)操作過程可形象歸納為： 小結(jié)小結(jié)分分分離獲取目的基因分離獲取目的基因 選選載體的選擇與構(gòu)建載體的選擇與構(gòu)建接接目的目的DNADNA與載體連接與載體連接 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)重組重組DNADNA轉(zhuǎn)入受體細胞轉(zhuǎn)入受體細胞篩篩重組體的篩選與鑒定重組體的篩選與鑒定重組重組DNA技術(shù)操作

38、的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交表達體系的建立：表達體系的建立： 表達載體的構(gòu)建表達載體的構(gòu)建 受體細胞的建立受體細胞的建立 表達產(chǎn)物的分離純化表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達（六）克隆基因的表達 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志選擇標(biāo)志 強啟動子強啟動子

39、 翻譯調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點多接頭克隆位點 E.coli表達體系的不足表達體系的不足：不宜表達真核基因組不宜表達真核基因組DNA；不能加工表達的真核蛋白質(zhì)；不能加工表達的真核蛋白質(zhì)；表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusion body) ；很難表達大量可溶性蛋白。很難表達大量可溶性蛋白。1. 原核表達體系原核表達體系 (E.coli表達體系最為常用表達體系最為常用) 優(yōu)點：優(yōu)點：可表達克隆的可表達克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達的蛋白質(zhì)可適當(dāng)修飾表達的蛋白質(zhì) 表達產(chǎn)物分區(qū)域積累表達產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點：缺點：操作技術(shù)

40、難、費時、經(jīng)濟操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 將表達載體導(dǎo)入真核細胞的過程將表達載體導(dǎo)入真核細胞的過程方法：方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射顯微注射 2.2.真核表達體系（酵母、昆蟲、乳類動物細胞）真核表達體系（酵母、昆蟲、乳類動物細胞）第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用Application of Recombinant DNA Technology in Medicine一、重組一、重組DNADNA技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物制藥技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物制藥 利用基因工程生產(chǎn)有藥用價值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一利用基因工程生產(chǎn)有藥用價值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為項重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。 美國美國Eli Lilly公司于公司于1982年首先利用重組年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投技術(shù)合成人胰島素并投放市場，標(biāo)志著生物工程藥物時代的開始。迄今為止，已有放市場，標(biāo)志著生物工程藥物時代的開始。迄今為止，已有50多種基多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術(shù)產(chǎn)因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會效益和經(jīng)濟效益。業(yè)，產(chǎn)生了不