PPT9-熒光定量PCR(2013.5.28徐歆改)

1、定量定量PCR：檢測(cè)檢測(cè)PCR反應(yīng)指數(shù)期某一點(diǎn)的反應(yīng)指數(shù)期某一點(diǎn)的PCR產(chǎn)物數(shù)量，由此產(chǎn)物數(shù)量，由此確定初始模板的數(shù)量。確定初始模板的數(shù)量。熒光定量熒光定量PCR （real-time Q-PCR）：）：是指在是指在PCR反應(yīng)體系中加反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線或內(nèi)參基因?qū)ξ粗０暹M(jìn)行定量分析的方法。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線或內(nèi)參基因?qū)ξ粗０暹M(jìn)行定量分析的方法。1996年由美國(guó)年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出該技術(shù)公司推出該技術(shù) 實(shí)現(xiàn)了實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍從定性到定量的飛躍

2、 特異性更強(qiáng)、有效解決特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)同一樣品盡管平臺(tái)期同一樣品盡管平臺(tái)期DNADNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，但拷貝數(shù)波動(dòng)很大，但指數(shù)期產(chǎn)物量相同指數(shù)期產(chǎn)物量相同PCRPCR反應(yīng)的前反應(yīng)的前1515個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（熒光本底信號(hào)（baselinebaseline），熒光信熒光信號(hào)之后進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段。號(hào)之后進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段。軟件自動(dòng)給出，無(wú)需手動(dòng)設(shè)置軟件自動(dòng)給出，無(wú)需手動(dòng)設(shè)置。熒光域值（熒光域值（ Threshold Threshold ）為為3 31515個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差

3、的標(biāo)準(zhǔn)偏差的1010倍倍（或（或本底的本底的2 2倍）。軟件自動(dòng)給出，可手動(dòng)設(shè)置。倍）。軟件自動(dòng)給出，可手動(dòng)設(shè)置。CtCt值值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到熒光域值時(shí)所需的循環(huán)數(shù)。：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到熒光域值時(shí)所需的循環(huán)數(shù)。Primer dimersProduct of Interest每擴(kuò)增一條每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)的累積與鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步產(chǎn)物形成完全同步 以以lg（CT）為縱坐標(biāo)，）為縱坐標(biāo)，lg（拷貝數(shù)）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（拷貝數(shù)）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率（擴(kuò)增效率（E）= （10-1/斜率斜率-1） 2將未知樣品的將未知樣品的CT值（值（y）代入線性方）代入線性方程求得對(duì)應(yīng)的程求得對(duì)應(yīng)的x未知樣品的拷貝數(shù)未知樣品的拷貝數(shù) = 10 x CtSample CtNon treated sampleHousekeeping Gene Ct Ct Ct2- Ct = Change in Expression LevelGene of Interest以以TAKARA SYBRTAKARA SYBR Premix ExPremix Ex TaqTaqTMTM II II為例為