顯微鏡原理、調(diào)試、使用和保養(yǎng)

1、顯微鏡原理、構(gòu)造、調(diào)試、使用和保養(yǎng)顯微鏡是人類認(rèn)識(shí)物質(zhì)微觀世界的重要工具，是現(xiàn)代科學(xué)研究工作不可缺少的儀器之 一。顯微鏡自 1666 年問世以來已有 300 多年的歷史了，其間隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，顯微 鏡的品種不斷增加，結(jié)構(gòu)和性能逐步得到完善和提高。 根據(jù)不同的使用用途，光學(xué)顯微鏡 可分為普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡、體視顯微 鏡、偏光顯微鏡等 10 多種。目前，世界上許多國家都可以生產(chǎn)光學(xué)顯微鏡，牌名、種類繁 雜，其中德國、日本等國制造的顯微鏡品質(zhì)、數(shù)量占優(yōu)勢，但價(jià)格昂貴。 對(duì)于現(xiàn)代的光學(xué) 顯微鏡， 包括各種簡單的常規(guī)檢驗(yàn)用顯微鏡、 萬能研究以及萬能照相

2、顯微鏡等， 首先要認(rèn)識(shí) 其構(gòu)造及各部件的功能， 同時(shí)要掌握正確的調(diào)試、 使用和保養(yǎng)方法， 才能在實(shí)際應(yīng)用中面對(duì) 各種要求時(shí)以不同的顯微鏡檢方法，充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的功能，提高常規(guī)檢驗(yàn)工作效率。光學(xué)顯微鏡的原理和構(gòu)造 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，顯微鏡檢方法由最傳統(tǒng)的明視野、暗視野發(fā)展出了相差法、偏光 方法； 熒光方法也由透射光激發(fā)進(jìn)展為落射光激發(fā)， 使熒光效率大為提高； 微分干涉相襯方 法基于偏光方法， 而巧妙地利用了微分干涉棱鏡， 使之能應(yīng)用于醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的樣品， 又能 應(yīng)用于金相樣品的分析與檢驗(yàn)。下面以德國 ZEISS 公司生產(chǎn)的 Axioplan 萬能研究用顯微鏡， 簡單介紹萬能顯微鏡的基本組

3、成部件。1. 顯微鏡主機(jī)體( stand ) 顯微鏡的主機(jī)體設(shè)計(jì)成金字塔形，而底座的截面呈 T 字形，使 顯微鏡的整體相當(dāng)穩(wěn)固。顯微鏡的光學(xué)部件和機(jī)構(gòu)調(diào)節(jié)部件、光源的燈室、顯微照相裝置、 電源變壓穩(wěn)壓器等，都可安裝在主機(jī)體上或主機(jī)體內(nèi)。2. 顯微鏡的底座( base ) 底座和主機(jī)體通常組成一個(gè)穩(wěn)固的整體。底座內(nèi)通常裝有透射 光照明光路系統(tǒng)(聚光、集光和反光)部件，光源的濾光片組，粗/微調(diào)焦機(jī)構(gòu)，光源的視場光闌也安裝在底座上。3. 透射光光源 ( tranilluminator ) 透射光光源由燈室 (lamp housing )、燈座( lamp socket )、 鹵素?zé)? halogen

4、 lamp )、集光與聚光系統(tǒng)( lamp collector and lamp condenser )及其調(diào) 整裝置組成。4. 透射光光源與反射光光源的轉(zhuǎn)換開關(guān) ( toggle switch ) 這是新一代 AXIO 系列顯微鏡特 有的裝置，透射光和反射光可通用。當(dāng)具有透/反兩用的配置時(shí)，利用這一轉(zhuǎn)換開關(guān)能方便而又迅速的使透射光和反射光互相轉(zhuǎn)換。在純透射光的配置中，這一開關(guān)就改為電源開關(guān)。5. 電源開關(guān)( mains switch )與亮度調(diào)節(jié)旋鈕( brightness control ) 電源開關(guān)用來接通或 切斷顯微鏡所需用的交流電源。 電源開關(guān)旋鈕也可調(diào)節(jié)照明光源的亮度， 使所觀察的

5、視域可 隨時(shí)獲得適當(dāng)?shù)牧炼龋?可調(diào)范圍為 3-12V 。作顯微照相時(shí)， 可根據(jù)曝光以及彩色底片色溫的 要求來調(diào)節(jié)燈光的亮度。當(dāng)準(zhǔn)備關(guān)掉電源之前，應(yīng)先將亮度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到最小。6. 粗、微調(diào)焦旋鈕( coaxial coarse/fine focusing controls ) 調(diào)焦旋鈕轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)帶動(dòng)燕尾導(dǎo) 板上下移動(dòng)， 而導(dǎo)板上則裝有物臺(tái)托架和聚光鏡托架， 從而使物臺(tái)趨向或遠(yuǎn)離物鏡達(dá)到調(diào)焦 的效果。7. 透射光用的濾光片選擇按鈕( push buttons for filter magazine ) 透射光顯微鏡檢方法 所需用的一組濾光片已安裝在顯微鏡的底座內(nèi)， 通過底座外的按鈕就可以根據(jù)不同的需要

6、來 選擇適用的一塊或一組濾光片。通常的濾光片配套有：(1) 藍(lán)色色溫轉(zhuǎn)換濾光片：用來把光源的色溫由 3200K 轉(zhuǎn)換成日光型彩色底片所需的 5500K 色溫；(2) 綠色濾光片：用來增強(qiáng)相差觀察方法中成像的反差，或者以黑白底片作顯微照相時(shí)，可 以提高片成像的反差；(3) 淺灰色濾光片：是透光率為 50% 的中性減光濾光片，可把視野的亮度減弱一半；(4) 灰色濾光片：是透光率為 25% 的中性減光濾光片，可把視野的高度減弱75% ；(5) 透光率僅為 6%的中性減光濾光片，可把視野的亮度變得相當(dāng)暗，95% 以上的光都已被吸收掉。8. 光源的視場光闌( luminuos field diaphra

7、gm ) 視場光闌是顯微鏡照明光路系統(tǒng)中的重 要部件之一， 它只能按照庫勒照明系統(tǒng)的要求來進(jìn)行調(diào)節(jié)， 視場光闌不可以任意開大， 但要 根據(jù)使用的物鏡倍數(shù)來調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)拇笮?。視場光闌的主要功用有：(1) 控制雜散光在成像光路系統(tǒng)中的影響，特別是免除雜散光對(duì)照相系統(tǒng)的干擾，使顯微照 相的底片不至于蒙上一層灰霧；(2) 控制照明光束的大小，使所觀察的視域能受到均勻的照明；(3) 在熒光顯微鏡檢方法中，可以把激發(fā)光限制在所需激發(fā)樣品的視域范圍內(nèi)，以防止視域 外的樣品過早受到激發(fā)。9. 聚光鏡系統(tǒng)( condenser system ) 聚光鏡系統(tǒng)是照明光路系統(tǒng)中的重要部件之一，它 也只能按照庫勒照明系統(tǒng)

8、的調(diào)整要求來進(jìn)行調(diào)節(jié)。 聚光鏡系統(tǒng)調(diào)整的好壞， 可以直接影響顯 微鏡視域中照明的均勻性， 也可影響顯微鏡的分辨力， 還可以直接控制顯微照相底片上的反 差。聚光鏡系統(tǒng)通常由以下幾個(gè)部件組成：(1) 聚光鏡本體( condenser ) 可以是簡單的阿貝聚光鏡，也可以是消球差-消色差的優(yōu)質(zhì)聚光鏡，另外還有一種是消除了內(nèi)應(yīng)力的偏光聚光鏡。聚光鏡的重要參數(shù)之一是數(shù)值孔徑(NA )，通常為 0.32 ；這樣的數(shù)值孔徑太小，只能與以下的物鏡配合使用，因此需配用前 端透鏡來提高數(shù)值孔徑，以便與不同倍數(shù)的物鏡靈活配合使用；(2) 前端透鏡( front lens ) 前端透鏡本身的數(shù)值孔徑通常為 0.63 、

9、0.90 、1.30 或 1.40， 它要附裝在聚光鏡本體上，可以方便地?cái)[進(jìn)或擺出光路。最常用的前端透鏡數(shù)值孔徑為0.90，當(dāng)它擺入光路時(shí)，可以和10X及以上的物鏡配用，擺出光路時(shí)可以和10X以下的物鏡如6.3 X、5X及2.5 等物鏡配用；(3) 聚光鏡的孔徑光闌( aperture diaphragm ) 孔徑光闌實(shí)際上是一個(gè)可變光圈，它是顯 微鏡照明光路系統(tǒng)中的又一個(gè)重要部件， 在透射光明視野法、 微分干涉相襯法以及偏光法所 使用的聚光鏡中， 都裝有孔徑光闌。 它可以影響顯微鏡在作觀察時(shí)的分辨力； 直接控制顯微 照相底片上的反差； 可用來調(diào)節(jié)聚光鏡的數(shù)值孔徑， 配合所用物鏡的數(shù)值孔徑，

10、以取得最佳 的分辨本領(lǐng)， 或最大的分辨本領(lǐng)； 還可以使光源的發(fā)光體成像于孔徑光闌所在的平面上，從而滿足庫勒照明系統(tǒng)的前提條件。在實(shí)際操作中， 調(diào)節(jié)聚光鏡孔徑光闌可以改變顯微鏡中所觀察到的視野亮度，這是由于歷史上對(duì)聚光鏡孔徑光闌的誤解所造成的錯(cuò)誤用法。 這里要特別強(qiáng)調(diào)： 不應(yīng)該用聚光鏡的孔徑光 闌來調(diào)節(jié)視野中的亮度、 更不應(yīng)該用調(diào)節(jié)聚光鏡位置高低的方法來調(diào)節(jié)視野中的亮度！ 以往 的錯(cuò)誤用法希望能在實(shí)際操作中糾正過來。(4) 轉(zhuǎn)盤(turret)在多用途聚光鏡系統(tǒng)中，為方便才把明視野的孔徑光闌、暗視野的中央光擋、相差法所需用的各種不同直徑的環(huán)狀光圈、微分干涉相襯法用的DIC棱鏡及其孔經(jīng)光闌等部件裝

11、在轉(zhuǎn)盤上再嵌入到聚光鏡本體的座子內(nèi)，使用時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤就可以選用不同顯微鏡檢法所適用的聚光鏡，方便而又快捷。聚光鏡系統(tǒng)有兩個(gè)調(diào)節(jié)裝置：a.聚光鏡的調(diào)中螺絲(centering screws )調(diào)中螺絲通常為1對(duì)，位于聚光鏡托架前方的左右測。和環(huán)形燕尾槽中的調(diào)中螺絲成三足鼎立之勢，可以聚光鏡前后、左右調(diào)整，使聚光鏡的光軸與照明光路、成像光路合軸；b.聚光鏡托架的上下調(diào)節(jié)裝置(vertical adjustme nt of con de nser carrier):利用這個(gè)調(diào)節(jié)裝置，可使聚光鏡的位置作上下調(diào)動(dòng)，使視場光闌經(jīng)過聚光鏡在樣品視野中的成像調(diào)到最為清晰，光闌像的位置也可利用托架上的調(diào)中螺絲來進(jìn)

12、行調(diào)中，從而滿足庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整的要求。10. 機(jī)械移動(dòng)式載物臺(tái)(specimen stage )載物臺(tái)可以承載樣品，裝有可在水平方向上作前后、左右移動(dòng)的調(diào)節(jié)裝置，有的還可以在水平方向上作大約100度的旋轉(zhuǎn)，以便使樣品能更好地與顯微照相的取景框相適配。11. 物鏡轉(zhuǎn)換器(nosepiece)物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在滑插式燕尾槽座上，已作了準(zhǔn)確的對(duì)中?？裳杆俑鼡Q物鏡。常用的有6個(gè)、5個(gè)及4個(gè)孔位的物鏡轉(zhuǎn)換器。12. 物鏡(objectives)物鏡是顯微鏡的核心光學(xué)部件，顯微鏡的放大倍數(shù)、分辨本領(lǐng)、色差與像差的校正狀況、工作距離等，都有直接由物鏡來決定。衡量物鏡質(zhì)量的基本參數(shù)主 要有：a.色差消正的程度

13、(或級(jí)別)； b.像場平坦的程度；c.所使用的玻璃材料。數(shù)值孔 徑(NA)是物鏡最重要的參數(shù)，數(shù)值孔徑越大，分辨率越高。目前物鏡的數(shù)值孔徑最大只 有1.30。按照物鏡色差和像差校正的程度，物鏡可以分為以下類別：(1) 消色差物鏡(achomats)通常對(duì)紅光與藍(lán)光兩種色光作了色差校正，但視域中像場的平坦程度并未作過完善的校正，因此只能作一般的觀察應(yīng)用。在偏光顯微鏡中，由于需要消除物鏡內(nèi)各個(gè)鏡片的內(nèi)應(yīng)力，反而需要利用這種鏡片數(shù)目不多的物鏡來做偏光物鏡。有限平像場消色差物鏡(flat-field achromats )這也是對(duì)兩種色光作了校正的消色差物鏡，但視域范圍內(nèi)像場的平坦程度只作了有限范圍內(nèi)

14、的校正，通常在顯微照相取景框范圍內(nèi)像場是平坦的，以確保顯微照相對(duì)焦的清晰，取景框范圍以外，往往不一定能保證同樣的清晰度。適用于常規(guī)檢驗(yàn)而又需要作顯微照相的工作中。完善平像場消色差物鏡(plan-achromats )這也是對(duì)兩種色光作了校正的高級(jí)消色差 物鏡，主要特點(diǎn)是像場在整個(gè)視域中作了完善的校正，適合于作要求較高的顯微鏡檢工作, 特別是作顯微照相效果更好。 由于這種物鏡仍采用常用的光學(xué)玻璃， 不適宜作熒光等這一類 弱光的觀察和照相。(4) 螢石玻璃消色差物鏡( neofluar ) 這也是對(duì)兩種色光作了色差校正的消色差物鏡，其 中全部或部分鏡片則采用了可透過近紫外光(波長約為 365nm

15、)的螢石玻璃(即氟化鈣晶 體)來制造。 因此特別適合于作熒光與相差方法的觀察與顯微照相，也可用在偏光顯微鏡中。(5) 完善平像場復(fù)消色差物鏡( plan-opo-chromats ) 這是最高一級(jí)的消色差物鏡，對(duì)紅、 綠、藍(lán) 3 種顏色都作了很好的色差校正，而視域中的像也作了完善的校正，數(shù)值孔徑比螢 石物鏡大， 可應(yīng)用于要求極高的顯微觀察與顯微照相中， 但價(jià)格十分昂貴， 由于所使用的鏡 片數(shù)目多達(dá) 12 片，光能損失較大，不宜用作熒光觀察與照相。(6) 已消除內(nèi)應(yīng)力又可以調(diào)節(jié)中心的物鏡( pol Z objectives ) 這是一種適用于作偏光觀察 的物鏡，是從以上所介紹的幾種物鏡中挑選出來

16、的， 在裝配時(shí)特別注意消除了其中的內(nèi)應(yīng)力， 以免內(nèi)應(yīng)力所引起的干涉條紋干擾了偏光樣品中真正的干涉條紋。(7) 完善平像場螢石消色差多種介質(zhì)浸沒式物鏡(plan-neofluar imm. ) 這是一種新型物鏡，采用螢石玻璃制造其中全部或部分鏡片， 成像質(zhì)量特別明亮， 反差十分好，色差接近于 復(fù)消色差， 因此又屬于半復(fù)消色差物鏡。 數(shù)值孔徑特別大， 透光能力強(qiáng)， 而且分辨率十分好。 最大的特點(diǎn)是可用好幾種浸沒介質(zhì)， 如常用的浸沒油、甘油、 蒸餾水等， 既可使用權(quán)蓋玻片 也可以不使用。 這種物鏡制成干式物鏡時(shí)， 可加上校正環(huán)， 用來校正蓋玻片的厚度不均勻性， 以消除蓋玻片厚度不規(guī)則造成的成像失真，

17、對(duì)于厚度在 0.12-0.22mm 之間的蓋玻片都可以 作相應(yīng)的校正。1986 年以來，德國蔡司公司推出的新一代光學(xué)顯微鏡，其中的物鏡突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡 的概念，采用了無限遠(yuǎn)色差校正的光學(xué)系統(tǒng)( infinity color-corrected system ，簡稱 ICS 物 鏡)，其特點(diǎn)是： 由物鏡射出的成像光束是一束平行光，可在成像光路中按需要插入任意多 的光學(xué)部件而不影響成像質(zhì)量。在顯微鏡鏡體內(nèi)有一特制的鏡筒透鏡(tube lens )與物鏡相配，兩者結(jié)合起來把物鏡的色差與像差都作了十分完善的校正， 而且物鏡的視域相當(dāng)寬闊， 比傳統(tǒng)物鏡的視域擴(kuò)大約 40% 。13. 熒光濾光片組插板

18、的插口( slot for the fluorescence slider ) 這是為作熒光觀察時(shí)插 入熒光濾光片組插板預(yù)留的插口。14. 勃氏鏡插板的插口 ( slot for Bertcand-lens slider ) 這是為作偏光觀察時(shí)插入勃氏鏡插 板預(yù)留的插口，勃氏鏡是偏光顯微鏡中用作錐光干涉圖試驗(yàn)的重要部件。15. 補(bǔ)色器插板的插口( slot for auxiliary objects ) 這是當(dāng)作微分干涉相襯觀察和偏光需 加入的各種補(bǔ)色器預(yù)留的插口。16. 雙目鏡筒或帶照相鏡筒的雙目鏡筒( binocular tubes or binocular phototubes ) 用來

19、 安放目鏡及照相裝置。為便于觀察，鏡筒制成具有一定傾斜角度(30°或 45°)，設(shè)有瞳距調(diào)節(jié)裝置，可在 55°至 75°范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，以適合不同使用者兩眼瞳孔距離。雙目鏡筒內(nèi)裝有 一些折光和分光棱鏡， 能把從物鏡出來的一束成像光束等分成兩部分， 分別由兩個(gè)目鏡作觀 察。帶照相鏡筒的雙目筒一般在右測裝有光束分配棱鏡的拉桿，把它全部推入時(shí)只作觀察， 拉出來則一邊觀察一邊照相，或全部作顯微照相。17. 目鏡( eyepieces ) 目鏡是顯微鏡中把物鏡所成的像作再一次放大的光學(xué)部件，顯微 鏡的總放大倍數(shù)通常就是物鏡與目鏡放大倍數(shù)的乘積。 為方便不同視力者進(jìn)行顯

20、微拍照時(shí)調(diào) 焦同樣清晰， 一些目鏡設(shè)計(jì)成可調(diào)焦式。 為了使顯微鏡獲得最大有效放大倍數(shù)和最高分辨本 領(lǐng)，必須合理選配目鏡。 到目前為止，由于受光學(xué)定律的制約，光學(xué)顯微鏡最大的有效放大 倍數(shù)為1250-1300倍。10X目鏡是最常用而必須配備的目鏡，觀察熒光時(shí)最好選用 10X以下的目鏡。顯微鏡的正確調(diào)試和使用 在了解了顯微鏡各主要部件的名稱、構(gòu)造和功能之后，為了更好地發(fā)揮顯微鏡的各種功能，提高工作效率， 保證在顯微觀察及顯微照相過程中取得最佳效果， 使用人員必須了解和 掌握顯微鏡正確的調(diào)試方法和使用方法。 尤其在新一代顯微鏡中， 具備了多種功能， 能進(jìn)行 多種顯微鏡檢方法觀察，正確的試調(diào)方法和使用

21、方法就顯得尤為重要。下面以Axioplan 萬能研究顯微鏡為例，簡述調(diào)試及使用方法。1. 顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整 為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明，在顯微 鏡初次安裝和調(diào)試時(shí)，就必須把照明光路系統(tǒng)調(diào)整好，這是正確使用顯微鏡，并獲得正確、 可靠結(jié)果的重要手段和最基本的要求。 此外， 正確掌握照明光路系統(tǒng)的調(diào)整， 是使用顯微鏡 過程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟， 也是在日常使用過程中不時(shí)地檢驗(yàn)顯微鏡性能的必要 手段。顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整主要有以下 4 項(xiàng)內(nèi)容：(1) 照明光源燈室在顯微外的初步調(diào)整 首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素?zé)襞菅b入插座中，安裝時(shí)避免手指直接接觸 燈泡(

22、可用柔軟的布或紙隔住)，以免燈泡上留有指紋等臟物，影響燈泡的使用壽命。 把燈室擺在桌面上，接通電源后，用專用的螺絲刀調(diào)節(jié)燈的調(diào)焦旋鈕孔(標(biāo)有, 使燈絲投影在 1-2m 外的墻上，將燈絲成像調(diào)至清晰；然后調(diào)節(jié)燈的高低位置調(diào)節(jié)絲孔(標(biāo)有“一）”使燈絲位置高低適當(dāng)；再調(diào)節(jié)燈的左右位置調(diào)節(jié)螺絲孔（標(biāo)有“一）”使燈絲左右位置合適。（2）光源發(fā)光體（燈絲）在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)和校正目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調(diào)入物鏡的視域范圍內(nèi)， 從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的前提條件。需要的基本工具：對(duì)中望遠(yuǎn)鏡購置顯微鏡時(shí)已配備。 拔掉燈庫內(nèi)的毛玻璃套筒，把燈室裝回顯微鏡

23、上； 選用10 物鏡，開亮光源程序找樣品并調(diào)焦清晰，再換用40 物鏡把樣品調(diào)焦清晰（40X物鏡可以看清燈絲的全貌）； 把聚光鏡的孔徑光闌和視場光闌均開到最大； 拔掉其中一個(gè)目鏡，換上對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，抓住白色部分，另一手伸縮黑色接目鏡，就可在 視野中看到燈絲像； 如燈絲位置不合適，調(diào)“孔，把燈絲像沿水平方向調(diào)好，調(diào)“一就；把絲像沿垂直方向調(diào)好，直至將燈絲像調(diào)至剛好充滿物鏡孔徑的光圓像； 調(diào)整完畢后，將毛玻璃套筒插回原位，拔掉對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡作下一步調(diào)整。以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調(diào)整和光源發(fā)光體在顯微鏡內(nèi)位置的校驗(yàn)，只需在顯微鏡初次安裝調(diào)試及更換燈泡時(shí)進(jìn)行， 平時(shí)使用顯微鏡時(shí)不能隨意亂調(diào)亂

24、動(dòng)。 萬一調(diào)亂時(shí)， 可 按上述步驟調(diào)回原狀。（3）庫勒照明（ Kohler ）系統(tǒng)的正確調(diào)整 顯微鏡的正確調(diào)試，主要工作之一是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整， 而其中的關(guān)鍵是庫勒照明系統(tǒng)的調(diào)整。 對(duì)于每一位使用顯微鏡的人員， 特別是作 顯微照相的人員來說， 應(yīng)該對(duì)庫勒照明系統(tǒng)的原理及其調(diào)整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的功能，拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善。 庫勒照明系統(tǒng)的原理簡單來說就是： 光源發(fā)光體上任意一點(diǎn)發(fā)出的光， 可以照明顯微鏡的視 域范圍， 而光源發(fā)光體上每一點(diǎn)所發(fā)出的光匯集起來， 在顯微鏡的視域中就實(shí)現(xiàn)了非常充分 而又均勻的照明。調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的目的， 是為了使所

25、觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明， 防止雜散光 對(duì)照相系統(tǒng)造成影響或干擾， 以免照相時(shí)在底片形成灰霧。 高調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的必要部件： 視場光闌、可進(jìn)行合軸調(diào)整的聚光鏡系統(tǒng)。 選用10 物鏡和10 目鏡; 把聚光鏡前端透鏡擺進(jìn)光路中，孔徑光闌調(diào)至適中的位置上（不大不?。?，再把聚光鏡升到最頂?shù)奈恢蒙?，聚光鏡轉(zhuǎn)盤調(diào)至明視野“竝置； 把視場光闌調(diào)至最?。?0.1 ）； 載物臺(tái)上放上已封片的生物樣品，開亮光源，調(diào)焦清晰； 視域中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)局部照明的區(qū)域或亮斑，這是視場光闌的模糊像，在其中可以清晰地 看到樣品的細(xì)節(jié)；在它之外是較暗的視域，不一定能把樣品的細(xì)節(jié)看得清楚； 把聚光鏡微微地向下調(diào)，使視野中的

26、亮斑逐漸收小，慢慢變成一個(gè)清晰的多邊形象，這 便是視場光闌的清晰像； 一般情況下，多邊形象并不在視域中央，需要調(diào)整聚光鏡的一對(duì)調(diào)中螺絲，把視場光闌 多邊形的像調(diào)至中央位置； 逐漸開大視場光闌，使多邊形象成為視域的內(nèi)接多邊形，進(jìn)一步核對(duì)調(diào)中的狀況，如對(duì) 中不夠理想，繼續(xù)微微調(diào)對(duì)中螺絲； 將視場光闌稍為再微微開大一些，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上，至此，庫 勒照明系統(tǒng)調(diào)整完畢。庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好以后，整個(gè)視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰，反差正常。 在日后使用過程中應(yīng)特別注意：a. 視場光闌不可任意開大，但可隨物鏡倍數(shù)的增大而將視場光闌收小，隨物鏡倍數(shù)的減小 而開大；b. 聚光鏡的高低

27、位置不準(zhǔn)亂調(diào)，否則會(huì)破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)；c. 使用10X以下物鏡時(shí)要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外，使用10X或 10X以上物鏡時(shí)要將前端透鏡擺入光路中；d. 關(guān)于物鏡倍數(shù)與視場光闌大小配合問題，在實(shí)際使用過程中，作為一般觀察不一定要收 小或開大視場光闌， 但作顯微照相時(shí)， 為了避免雜散光線對(duì)照相系統(tǒng)的干擾， 以便能拍攝到 較完善的照片， 則應(yīng)在使用每一個(gè)倍數(shù)的物鏡時(shí)， 把視場光闌調(diào)節(jié)到正好消失于所觀察的視 域邊上， 這是比較繁復(fù)的工作， 但又非做不可。 較為簡便的方法是把與各個(gè)倍數(shù)物鏡相對(duì)應(yīng) 的視場光闌事先調(diào)整好，并作好記號(hào)，以后使用時(shí)根據(jù)記號(hào)直接調(diào)至相應(yīng)的位置。（4）孔徑光闌的正確使用

28、 由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率， 使用時(shí)應(yīng)掌握 正確的使用方法。過去由于對(duì)孔徑光闌的認(rèn)識(shí)不足，往往把它當(dāng)作是調(diào)節(jié)視野亮度的工具。 雖然調(diào)節(jié)孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度，但會(huì)直接影響成像的反差、 對(duì)比度及分辨率，在使用過程中應(yīng)盡可能避免。為了發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用， 以便在觀察時(shí)， 尤其在作顯微照相時(shí)獲得最佳分辨率， 在 每換用一個(gè)倍數(shù)的物鏡時(shí)， 在樣品調(diào)焦清晰后， 需要調(diào)節(jié)孔徑光闌， 使它的大小正好等于所 用物鏡數(shù)值孔徑(物鏡孔徑像)的 2/3 。 調(diào)整方法是用對(duì)中望遠(yuǎn)鏡對(duì)焦于視野中黑色相差環(huán)上， 調(diào)節(jié)孔徑光闌， 可以看到一個(gè)多邊形 的孔徑光闌像，然后調(diào)到等于物鏡孔徑

29、像的 2/3 ，即介于黑色相差環(huán)外與圓形視域內(nèi)之間。 為方便起見， 可把與各倍數(shù)物鏡相對(duì)應(yīng)的孔徑光闌預(yù)先調(diào)整好， 并作好標(biāo)記， 以免每次使用 都要重新調(diào)整。2. 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術(shù)概要 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不 同顯微鏡檢術(shù)的需要而進(jìn)行的。所謂顯微鏡檢術(shù)( microscopy )，概括而言就是以顯微鏡 觀察樣品時(shí)所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法。 以下簡述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對(duì)應(yīng)的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法。(1) 透射光明視野( brightfield ) 這是自顯微鏡發(fā)明以來最傳統(tǒng)、最普遍的應(yīng)用方法。 基本部件：

30、a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察；b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。 調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后，即可應(yīng)用明視野法。 適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。注意事項(xiàng)：a. 使用明視野方法觀察時(shí)，一定要將庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好；b. 視場光闌不可任意開大，使用10X、10X以下和10 x以上物鏡時(shí)，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實(shí)出和擺進(jìn)光路中；c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野的亮度，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則，會(huì) 降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)；d. 作顯微照相時(shí)，每換用一個(gè)倍數(shù)的物鏡，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好 等于

31、所用物鏡數(shù)值孔徑的 2/3 。(2) 透射光相差法( phase-contrast ) 這是現(xiàn)代顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強(qiáng)法。 基本部件：相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對(duì)中望遠(yuǎn)鏡、綠色濾光片。 調(diào)整方法：a. 在庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎(chǔ)上，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰；b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到 Phi對(duì)準(zhǔn)轉(zhuǎn)盤刻度線位置，選用10 x相差物鏡，換上待觀察的透明樣品；c. 拔掉其中一個(gè)目鏡，換上對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，并調(diào)焦于視野中的兩個(gè)相差環(huán)上(物鏡的黑色相 差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán))；d. 視野中的兩個(gè)相差環(huán)不一定重合，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個(gè)調(diào)節(jié)裝置(調(diào)整相差環(huán)左右位置 的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕

32、)，使透光環(huán)作前后左右移動(dòng)而與黑環(huán)重合；e. 調(diào)整好后，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像；f. 有20 x和40 x物鏡觀察時(shí)，聚光鏡應(yīng)設(shè)在 Ph2位置上，用100物鏡時(shí)，聚光鏡應(yīng)設(shè)在 Ph3 位置上。適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種細(xì)胞、活組織、未染色或不 染色的組織切片、水生生物等。(3) 微分干涉相襯法( differential interference-contrast ， DIC ) 為了克服相差法觀察時(shí)樣 品細(xì)節(jié)像周圍伴隨有光暈， 會(huì)掩沒掉本來應(yīng)該看見的細(xì)節(jié)， 以及樣品或組織切片厚度要求相 當(dāng)薄，原則上下能厚于 10?m 等局

33、限性，利用雙光束干涉的原理設(shè)計(jì)子微分干涉相襯法。 調(diào)整方法a. 必須在庫勒明系統(tǒng)已調(diào)好的基礎(chǔ)上才能調(diào)好 DIC 方法；b. 先用10x物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調(diào)焦位置；c. 把起偏器( polarizer )擺入照明光路中，注意其取向應(yīng)為東 西方向；d. 把聚光鏡轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)到與 10x物鏡對(duì)應(yīng)使用的位置上，即DIC 0.3 0.4 ;e. 在物鏡后方或物鏡轉(zhuǎn)換器上插入10 x物鏡使用的DIC插片(DIC slider );f. 把檢偏器( analyser )插入成像光路中，注意其取向應(yīng)為南 北方；g. 換上待觀察的透明樣品，開亮光源把樣品調(diào)焦清晰；h. 調(diào)節(jié) DIC 插片，使微

34、分干涉相襯的像達(dá)到最佳效果，也就是浮雕效果最為明顯；i. 同時(shí)可調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達(dá)到最佳；j. 然后再細(xì)微調(diào)樣品的細(xì)節(jié)，可見樣品中不同層面上的結(jié)構(gòu)；k. 如果把補(bǔ)色器( first order red retardation plate )插入，并同時(shí)調(diào)節(jié) DIC 插片，可在視野 中看到不斷變化的絢麗色彩，紅、橙、黃、綠、藍(lán)、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用 范圍：透明或不能染色的組織切片，厚度可達(dá) 100?m 左右，培養(yǎng)中的活組織和活細(xì)胞、小 生生物等。(4) 落射光激發(fā)的熒光法( incident-loght fluorescence Epi-FL ) 簡稱為落射熒光

35、法，是近 代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來的一種強(qiáng)有力的反差增強(qiáng)法。 它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品， 透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便，效率高， 50W 的光源強(qiáng)度比透射熒光法的 250W 還強(qiáng)。熒光方法是利用波長較短的紫外光、 紫光、藍(lán)紫光、 藍(lán)光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中 含有可產(chǎn)生熒光的成分， 它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長較長的熒光。 不同物質(zhì)只能吸 改特定波長的激發(fā)光，而釋放的熒光也會(huì)有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效， 如某些致病的細(xì)菌和螺旋體， 受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光， 很容易作出

36、鑒定， 這 種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光法。 某些物質(zhì)自身不會(huì)吸收激發(fā) 光，或吸收后不能釋放熒光， 但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料， 而這些特定的熒光 色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)， 這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。 調(diào)整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調(diào)整的方法大致相同。 汞燈的安裝a. 打開包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時(shí)注意手指不能直接接觸燈 管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對(duì)向散熱帽的左側(cè)或右側(cè)；b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散

37、熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引 線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定；c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應(yīng)的螺絲， 再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專用的插座上。d. 詳細(xì)的安裝方法請(qǐng)參照有關(guān)說明書。 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調(diào)整：a. 接通汞燈電源，讓汞燈預(yù)熱 10-15min ；b. 把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到 2-3m 外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線對(duì) 地高度一樣的水平線作為參考線；c. 轉(zhuǎn)動(dòng)燈室調(diào)焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上；d. 分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的 5 個(gè)調(diào)節(jié)螺絲孔，把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量

38、靠近，但 不要重疊在一起。 汞燈汞弧在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)：a. 將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場光闌開到最大；b. 把熒光濾光片組推到藍(lán)光激發(fā)的位置上，以避免汞燈中的藍(lán)光太刺眼；c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺(tái)上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙；d. 取下一個(gè)物鏡，使激發(fā)的藍(lán)光經(jīng)物鏡轉(zhuǎn)換器的空檔照在白紙上，白紙上會(huì)有一藍(lán)色的圓 形照明區(qū)域， 汞弧的像及其反射像都應(yīng)該出現(xiàn)在這區(qū)域的中央部位， 否則， 可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦 旋鈕至最清晰，然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的 5 個(gè)調(diào)節(jié)螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并 排在照明區(qū)域的中央位置。e. 調(diào)好之后，把物鏡裝回去，通過目鏡可見白紙被藍(lán)光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光；f. 仔細(xì)調(diào)焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細(xì)節(jié)隱約可見而很容易調(diào)焦清晰。 汞燈使用注意事項(xiàng) 目前通常使用的為 50W 超高氣壓汞燈，燈管內(nèi)通有一對(duì)鎢電極和 液態(tài)汞(室溫下附在管壁上)，未點(diǎn)燃時(shí)，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā) 點(diǎn)燃后， 汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強(qiáng)光， 溫度升高，