免疫親和層析法快速純化豬瘟病毒抗體

1、豬瘟是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus引起的一種高傳染性疾病,死亡率高,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展。由于多種因素的影響,豬瘟疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定,影響了豬瘟防治的效果1。另一方面,豬仔的母源抗體對疫苗免疫具有抑制作用2-3。有研究報(bào)道4,通過口服或注射豬瘟抗體能夠直接提高豬仔的免疫力,降低豬仔的發(fā)病率和死亡率。因此,低成本、快速純化豬瘟抗體在豬瘟的診斷和防治中具有重要意義。由于抗體制備方法、抗體生產(chǎn)、表達(dá)系統(tǒng)的多樣性,使得抗體的分離純化技術(shù)復(fù)雜多樣。沉淀法和親和層析、離子交換層析等方法均有應(yīng)用5。本實(shí)驗(yàn)基于免疫親和層析原理,將豬瘟病毒固定于惰性載體上作為配基,從高免疫豬血清

2、中分離純化豬瘟病毒抗體,旨在建立一種成本低、快速有效純化豬瘟病毒抗體的方法。1.材料與方法1.1細(xì)胞及病毒豬傳代腎細(xì)胞系PK-15由本課題組保存;豬瘟病毒由廣東肇慶益信農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。1.2主要試劑HRP標(biāo)記的兔抗豬lgG和脫脂奶粉購自Sigma 公司;Sepharose-4B和Sephadex G-75購自Amersham 公司;DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清等細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購自廣州斯佳生物科技有限公司;豬瘟病毒高免疫豬血清由廣東肇慶益信農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供;其他化學(xué)試劑均為分析純或化學(xué)純,購自廣州化學(xué)有限公司。1.3豬瘟病毒的培養(yǎng)及純化將PK-15細(xì)胞株復(fù)蘇,在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情

3、況,當(dāng)細(xì)胞生長增殖至鋪滿單層后,進(jìn)行細(xì)胞傳代。待PK-15細(xì)胞長至70%80%融合時(shí),接種豬瘟病毒,37培養(yǎng)1h后,加入維持培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)72h后取出,反復(fù)凍融3次,4,10000r/min基金項(xiàng)目:暨南大學(xué)自然科學(xué)基金(109057;640073.作者單位:暨南大學(xué)生物工程學(xué)系(廣州510632.通訊作者:李任強(qiáng),E-mail:trqli 【實(shí)驗(yàn)技術(shù)】免疫親和層析法快速純化豬瘟病毒抗體封琳王桂珍李陽李任強(qiáng)【摘要】目的應(yīng)用免疫親和層析技術(shù)快速純化豬瘟病毒抗體。方法將豬瘟病毒接種于豬傳代腎細(xì)胞PK-15中培養(yǎng),收獲并純化豬瘟病毒,將其與環(huán)氧氯丙烷活化的Sepharose-4B偶聯(lián),制備免疫親和

4、層析柱,從豬瘟病毒高免疫豬血清中純化豬瘟病毒抗體,分別應(yīng)用SDS-PAGE和ELISA進(jìn)行抗體純度和活性檢測。結(jié)果自制免疫親和層析柱的偶聯(lián)率為0.36mg抗原/g 載體;純化的豬瘟病毒抗體純度高,活性強(qiáng),抗體回收率占豬血清總蛋白的2.45%。結(jié)論已建立了成本低、可快速有效純化豬瘟病毒抗體的免疫親和層析法?！娟P(guān)鍵詞】免疫親和層析;豬瘟病毒;高免疫豬血清【中國圖書分類號】S852.65+1R392-33【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1004-5503(201110-1233-03Rapid Purification of Antibody against Classical Swine Fever

5、Virus by Im-munoaffinity ChromatographyFENG Lin,WANG Gui-zhen,LI Yang,LI Ren-qiang(Department of Biotechnology,Jinan University,Guangzhou 510632,China【Abstract】Objective To purify the antibody against classical swine fever virus by immunoaffinity chromatography.Methods Classical swine fever virus wa

6、s inoculated to subcultured pig kidney PK-15cells and incubated.The harvested virus was purified and coupled with epichlorohydrin-activated Sepharose-4B to prepare immunoaffinity chromatographic column by which the antibody against classical swine fever virus was purified from hyperimmune sera of pi

7、gs and determined for purity and activity by SDS-PAGE and ELISA respectively.Results The coupling rate of prepared immunoaffinity chromatography column was0.36mg antigen/g carrier. The purified antibody against classical swine fever virus showed high purity and activity,of which the recovery rate of

8、2.45%of total serum protein.Conclusion A low-cost,rapid and effective immunoaffinity chromatographic method for purification of antibody a-gainst classical swine fever virus was successfully developed.【Key words】Immunoaffinity chromatography;Classical swine fever virus;Hyperimmune pig serum離心15min,收

9、集上清,加入80%飽和度的硫酸銨,鹽析過夜,離心收集沉淀,以0.02mol/L的PBS (pH7.4溶解,對水透析除去鹽。將透析液上樣于1.5cm×32cm的Sephadex G-75分子排阻層析柱,以0.2ml/min流速的去離子水洗脫,收集波長280nm處有光吸收的第1個(gè)洗脫峰,真空冷凍干燥,適度濃縮,獲得豬瘟病毒。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度6。1.4免疫親和層析柱的制備1.4.1Sepharose-4B的活化:將適量的Sepharose-4B 于燒結(jié)漏斗中抽濾去除液體,稱取8g(濕重于漏斗上,分別以100ml1mol/L NaCl和100ml蒸餾水洗滌,抽干后,移至小三角瓶內(nèi)

10、,加入6.5ml2mol/L NaOH、1.5ml環(huán)氧氯丙烷、15ml56%的1,4-二氧六環(huán),于37恒溫?fù)u床中振搖活化2h后取出,在燒結(jié)漏斗中以蒸餾水和0.2mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH9.5洗滌,抽干。1.4.2豬瘟病毒抗原與活化載體的偶聯(lián):將10ml 純化的豬瘟病毒與活化的Sepharose-4B混合,37振蕩24h,測定未結(jié)合的病毒抗原量,計(jì)算偶聯(lián)率,以每克Sepharose-4B(濕重結(jié)合抗原的毫克數(shù)表示。將所得已偶聯(lián)病毒的載體制備成1.0cm×10cm 的親和層析柱。1.5豬瘟病毒抗體的純化分別用Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH9.5、去離子水

11、和NaAc-HAc緩沖液(pH3.4、去離子水洗滌親和層析柱,用0.02mol/L的PBS(pH7.4平衡。將高免疫豬血清用水4倍稀釋,以0.2ml/min流速上樣,再用0.02mol/L的PBS(pH7.4平衡,洗脫未被吸附的雜蛋白(穿透峰,A280,繼續(xù)平衡至穿透峰的A280值降至基線。用含0.5mol/L NaCl的0.02mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH3.4進(jìn)行洗脫,收集洗脫峰。將洗脫峰液、穿透峰液先用去離子水透析后,真空冷凍干燥濃縮,計(jì)算抗體提取率,并行12% SDS-PAGE鑒定,采用電泳分析系統(tǒng)對電泳圖像進(jìn)行分析。1.6純化豬瘟病毒抗體活性的測定采用間接ELISA法。將

12、豬瘟病毒抗原用0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液按11500稀釋,包被酶標(biāo)板,4過夜;用1.5%脫脂奶粉封閉,37孵育1h;洗滌,將純化的豬瘟病毒抗體倍比稀釋,加入酶標(biāo)板中,37孵育1h;洗滌,加入HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG(15000稀釋,37孵育1h;洗滌,加入顯色液(TMB,避光顯色15min;以2mol/L H2SO4終止反應(yīng),在波長450nm 處測定各孔A值7。2.結(jié)果2.1免疫親和層析柱的偶聯(lián)率經(jīng)計(jì)算,自制免疫親和層析柱的偶聯(lián)率為0.36mg 抗原/g載體。2.2純化豬瘟病毒抗體的鑒定免疫親和層析圖譜見圖1。大峰為流穿峰,小峰為洗脫峰。SDS-PAGE分析可見,洗脫峰液包含4條帶,其相

13、對分子質(zhì)量分別約為75000、55000、25000和24000,見圖2。經(jīng)計(jì)算,平均每毫升高免疫豬血清中純化出豬瘟病毒抗體24.1mg,回收率為豬血清總蛋白的2.45%。圖1高免疫豬血清蛋白經(jīng)Sepharose-4B免疫親和層析柱的洗脫圖譜Fig1.Elution profile of high immune pig serum pro-tein from Sepharose-4B immunoaffinity chromatographic column1:洗脫峰;2:流穿峰;M:低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker 圖2免疫親和層析各蛋白樣品的SDS-PAGE分析Fig2.SDS-PAGE

14、profile of proteins purified by im-muneaffinity chromatography2.3純化豬瘟病毒抗體的活性ELISA檢測結(jié)果顯示,隨著純化豬瘟病毒抗體稀釋倍數(shù)的增加,其相對應(yīng)的A450值逐漸下降,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.9848,見圖3。表明豬瘟病毒抗體隨著M r12M M r75000550002500024000972006640044300290002010014300A28時(shí)間(min408012016020012345濃度的增加,與抗原結(jié)合的能力也增強(qiáng),說明純化的豬瘟病毒抗體活性正常。 圖3不同稀釋倍數(shù)的純化抗體在波長450nm 處的吸光率Fi

15、g 3.Absorbance at 450nm of purified anti body at various dilution folds3.討論本實(shí)驗(yàn)根據(jù)免疫親和層析原理,將豬瘟病毒固定于惰性Sepharose-4B 載體上作為配基制備免疫親和層析柱,從高免疫豬血清中分離純化豬瘟病毒抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,所制備的層析柱不僅抗原偶聯(lián)率高,且純化豬瘟病毒抗體效果較好。說明作為配基的病毒抗原并未因與載體發(fā)生固定反應(yīng)而失去與抗體的特異性結(jié)合能力。在實(shí)踐中,一些配基由于固定反應(yīng)會發(fā)生化學(xué)性質(zhì)的改變,甚至喪失作為配基的功能。因此,親和層析分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵不僅要找到配基,還依賴于配基固定后是否仍具有活

16、性。本文純化得到的豬瘟病毒抗體占免疫豬血清總蛋白的2.45%,回收率較高。經(jīng)SDS-PAGE 分析和ELISA 檢測,純化的豬瘟病毒抗體純度較高且活性正常。免疫球蛋白有4條鏈,包括兩條輕鏈和兩條重鏈。輕鏈有約241個(gè)氨基酸殘基,相對分子質(zhì)量約為24000;重鏈有450550個(gè)氨基酸殘基,相對分子質(zhì)量約為50000750008。本實(shí)驗(yàn)SDS-PAGE 得到的4條帶與免疫球蛋白的兩條重鏈和兩條輕鏈相符合,證明經(jīng)免疫親和層析已純化出與豬瘟病毒特異性結(jié)合的抗體。本實(shí)驗(yàn)制備的免疫親和層析柱具有可反復(fù)利用、一步操作即可完成、回收率高等優(yōu)點(diǎn),而且豬瘟病毒高免疫血清來源豐富。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功建立了成本低、

17、快速高效、適合實(shí)際應(yīng)用的快速純化豬瘟病毒抗體的方法。參考文獻(xiàn)1韓雪清,劉湘濤,趙啟祖.豬瘟病毒及其豬瘟疫苗研究進(jìn)展J .動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2000,21(2:1-7.2王永芬,席磊,邊傳周,等.豬血清免疫球蛋白對新生仔豬生產(chǎn)性能的影響J .中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,24(8:36-38.3賈永起,房慧伶,曾蕓.替米考星和甲硝唑?qū)ωi體液免疫和細(xì)胞免疫的影響J .中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)分會第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集,2008.4滑靜,曹永春,萬善霞,等.飼喂豬血漿IgG 對仔豬血液生化指標(biāo)和平均日增重的影響J .2004,21(1:36-37.5孫維敏.抗體純化中親和色譜配體的研究進(jìn)展J

18、.離子交換與吸附,2005,21(3:283-288.6李建武,余瑞元,袁明秀,等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法M .北京:北京大學(xué)出版社,2004:240-242.7Paul K ,Manjula J ,Deepa EP ,et al .Anti-Echis carinatus venomantibodies from chicken egg yolk :isolation ,purification and neu-tralization efficacy J .Toxicon ,2007,50(7:893-900.8周光炎.免疫學(xué)原理M .上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2007:52.(收稿日期:2010-12-14123456A 450稀釋倍數(shù)3.0002.5002.0001.5001.0000.5000.000【消息】征稿中國生物制品學(xué)雜志為報(bào)道我國生物制品研究開發(fā)重大成果和國內(nèi)