cas9技術(shù),靶向基因組定點精準(zhǔn)靶向修飾技術(shù)_CRISPR-Cas9

1、新技術(shù)介紹新技術(shù)介紹CRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)基因系統(tǒng)基因修飾技術(shù)修飾技術(shù)匯報人：李新匯報人：李新時間：時間：2013年年5月月9日日2中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1 CRISPR-Cas概述概述u1987年，日本大阪大學(xué)（年，日本大阪大學(xué)（Osaka University）在對一種細菌）在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶（編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進行研究時，）基因進行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的片

2、段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。兩端還存在一段不太長的特有的序列。u2013以后，研究者們在包括以后，研究者們在包括science和和nature biotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。的基因修飾。3中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1 CRISPR-Cas概述概述CRISPR-Cas：一種來源是細菌獲得性免疫的由：一種來源是細菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)指導(dǎo)C

3、as蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。4中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院CRISPR-Cas主要由兩部分組成：主要由兩部分組成：識別識別切割切割1 CRISPR-Cas概述概述5中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一個特殊的是一個特殊的DNA重復(fù)序列家族重復(fù)序列家族, 廣泛分布于廣泛分布于細菌和古細菌基因組中。細菌和古細菌基因組中。CRISPR 位點通常由短的高度保守位點通常由短的

4、高度保守的重復(fù)序列的重復(fù)序列(repeats) 組成組成, 重復(fù)序列的長度通常重復(fù)序列的長度通常 2148 bp, 重復(fù)序列之間被重復(fù)序列之間被 2672 bp 間隔序列間隔序列(spacer)隔開。隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列（就是通過這些間隔序列（space）與靶基因進行識別。）與靶基因進行識別。6中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)7中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.2 Cas家族家族Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guid

5、e RNA引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它與引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它與folk酶功能類似，酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。8中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進行通過對入侵的病毒和核酸進行特異性特異性的識別，利用的識別，利用Cas蛋白進蛋白進行切割，從而達到對自身的免疫。行切割，從而達到對自身的免疫。9中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的

6、發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)10中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)11中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細胞針對外源系統(tǒng)賦予原核細胞針對外源DNA特異性免特異性免疫疫, 而這種特異性是由間隔序列（而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細菌進化了菌進化了CRISPR 介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由揮是由CR

7、ISPR 間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增加或刪間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增加或刪除間隔序列（除間隔序列（spacer）來實現(xiàn)的。）來實現(xiàn)的。12中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。13中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求 在人類基因組中，平均每在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個就出現(xiàn)一個NGG PAM。14中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系

8、統(tǒng)靶向要求15中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3 CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾16中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換介導(dǎo)編輯模板替換 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系系統(tǒng)用設(shè)計好的統(tǒng)用設(shè)計好的DNA模板替換的相應(yīng)基因來達到基因的定向模板替換的相應(yīng)基因來達到基因的定向修飾。修飾。

9、17中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換介導(dǎo)編輯模板替換18中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾。內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾。19中山大學(xué)生命科學(xué)

10、學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾20中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾21中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾Cas9sg-RNA22中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 2013年年2月月15日在日在science上發(fā)表的上發(fā)表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文一文中，作者利用一個包含兩個靶向不同基因的中，作者利用一個包含兩個靶向不同基因的spacers的

11、的crRNA實現(xiàn)了同時對兩個基因進行編輯。實現(xiàn)了同時對兩個基因進行編輯。3.3 cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 23中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.3 cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 24中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 這是一項靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項極具有這是一項靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項極具有可能獲得諾貝爾獎技術(shù)?？赡塬@得諾貝爾獎技術(shù)。25中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 2013年年4月月12日在日在cell stem c

12、ell上發(fā)表的上發(fā)表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者一文中，作者利用利用TALENs和和CRISPRs對同一基因進行修飾，效率分別為對同一基因進行修飾，效率分別為0%-34%和和51%-79%。26中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 而且從實際應(yīng)用的角度來說，而且從實際應(yīng)用的角度來說，CRISPRs比比TALENs更更容易操作，因為每一對容易操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPR的的gRNA只需要替換只需要替換20個核苷酸就行。個核苷酸就行。27中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析u 只需合成一個只需合成一個sgRNA就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。蛋白不具特異性。u 編碼編碼sgRNA的序列不超過的序列不超過100bp，因此比構(gòu)建，因此比構(gòu)建TALENs和和ZF